Name: 형광에 원위치 하이브리드화 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 맛이 좋은 확장기의 사정 Biofilm 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 배우세요 형광 원위치 하이브리드화와 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 교정용 확장기에서 구강 바이오필름을 분석하는 방법을. 이 기술은 구강 미생물학 연구와 치주 질환 관계 이해에 활용됩니다.

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이 작품은 의과 대학 그라츠의 위생 Fonds에 의해 지원되었다. 모든 과목들은 정보에 동의했다. 연구 프로토콜의 기관 승인 의과 대학 그라츠로부터 얻은 것입니다.

1. 표본 수집 <ol><li> intraoral 서비스 4 개월 후 고정 맛이 좋은 확장기를 제거합니다. 그들 (그림 1 및 2) 제거하기 전에 어플 라이언 스를 분리 놀라 드라이 필드 시스템을 사용합니다. </li><li> 오염을 (그림 3, 4) 추가하지 않고 확장기를 제거하는 소독 펜치, 장갑과 쟁반을 사용합니다. </li><li> -20 ° C.에 Sarstedt 120 ML 튜브 안에 저장 개체 24 시간 이내에 얼음과 프로세스에 대한 실험실 소요됩니다. </li></ol> 2. Biofilm의 고정 <ol><li> 무균 메스 biofilm 부스러기를 긁어, 또는 멸균 집게와 조각을 수집합니다. </li><li> 샘플이 잘 적용되기 전까지 얼음처럼 차가운 4% PFA 솔루션을 추가합니다. </li><li> 4에서 혼합물을 품어 ° C 3-12시간위한 (동결하지 않음). 긴 고정 시간 이상 고정 온도는 oligonucleotide 프로브 적게 투과 그람 음성 세포의 세포 봉투를 렌더링 수 있습니다. </li><li> PFA 솔루션을 제거하고 얼음처럼 차가운 1X PBS로 세척. R이 단계에게 2-3 번 반복잔류 PFA를 emove. </li><li> 1 권에서 샘플을 Resuspend. 얼음처럼 차가운 1X PBS과 추가 1 권. 얼음처럼 차가운 96% (V / V) 에탄올. </li><li> -20 ° C.에있는 샘플을 저장 이 프로토콜에 따라 고정 샘플 년 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 고정 샘플의 탈수 <ol><li> 현미경 슬라이드에 PFA - 고정 샘플 자료 5-30 μl을 적용합니다. </li><li> 46시 드라이 ° C 15 분 이상 실온에서. 라이 소 자임과 포름 아미드를 해동. </li><li> 따라서 세포 벽의 부분 파괴하여 세포에 프로브의 침투를 촉진 10 분 상온에서 라이 소 자임 (1mg/ml) 250 μl를 추가합니다. </li><li> 50 %, 80 % 96% (V / V) 3 분 각각 에탄올로 물놀이 슬라이드. 에탄올 농도 시리즈의 dehydrating 효과는 세포 세포막을 분해합니다. </li><li> ° C 10 분에 대해 46에서 슬라이드를 건조시킵니다. </li></ol> 4. 원위치 하이브리드화 <ol><li> 1 ML 준비신선한 하이브 리다이 제이션 버퍼 (농도에 대한 표 1 참조). 이 연구에 사용된 포름 아미드 농도 : 10 % (EUBmix), 20 % (Bac303, POGI, MUT590) 또는 45 % (LGCmix). </li><li> oligonucleotide 프로브 솔루션을 녹여. 해동 프로브는 얼음에 보관하고 빛으로부터 보호되어야합니다. </li><li> 하이브 리다이 제이션 버퍼 200 μl 각 프로브 2 μl를 추가, 잘 섞어 현미경 슬라이드에 건조 표본으로 혼합물을 적용합니다. </li><li> 사각형 페트리 접시에 조직 종이를 삽입하고 티슈에 남아있는 하이브 리다이 제이션 버퍼를 부어. </li><li> 바로 그릇에 가로 슬라이드를 장소와 요리를 닫습니다. 46 ° C에서 1-5시간 (90 분 대부분의 경우 충분합니다) 오븐에 품어. 수분 챔버로 요리 기능은 슬라이드에서 하이브 리다이 제이션 솔루션의 증발을 방지. 특히, 포름 아미드의 증발이 아닌 목표 세포가 아닌 특정 탐사선이 바인딩을 일으킬 수 있습니다. </li><li> (conce에 대한 표 2를 참조하십시오 세척 버퍼의 50 ML 준비ntrations). 48 50 ML 튜브와 앞서 열을 가하다에서 세탁 버퍼를 준비 ° C 물 목욕 인치 세척 단계는 48 ° C.에 수행됩니다 </li><li> 하이브 리다이 제이션 오븐에서 슬라이드로 접시를 제거합니다. 즉시 미리 예열 세척 버퍼의 작은 볼륨으로 하이브리드화 버퍼 씻어, 나머지 세척 버퍼에 슬라이드를 전송합니다. </li><li> 10-15 분 48 ° C에서 물이 욕조 및 부화로 다시 세척 버퍼와 슬라이드가 들어있는 튜브를 놓습니다. </li><li> 튜브에서 슬라이드를 제거하고 잔류 세척 버퍼를 제거하는 2~3초 위해 얼음처럼 차가운 ddH 2 O로 물놀이. </li><li> 가능한 한 빨리 슬라이드 (압축 공기의 사용이 권장됩니다) 공기 건조. 빠른 건조가 프로브 분리를 줄일 수 있습니다. </li><li> 말린 슬라이드는 프로브 - 수여 형광 신호의 상당한 손실없이 몇 주 동안 -20 ° C에서 어둠에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 5. 현미경 사용법 <ol><li> 후 생선 세척, appl슬라이드의 왼쪽과 오른쪽 엔드 (냉동 슬라이스가 이전 단계로 실내 온도로 예열한다)에 antifadent 가까이 Y 두 방울. </li><li> 현미경 커버가 상단에 실수 antifadent가 전체 슬라이드에 걸쳐 때까지 기다려 놓습니다. antifadent의 과도한 양의 현미경 이미지를 흐려 수 있습니다. </li><li> 적절한 필터 또는 레이저를 갖춘 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 샘플을 관찰합니다. 우리는 Leica TCS 단위 (; NA 1.2 HCX PL APO/63x)를 사용합니다. 데이터는 같은 IMARIS 또는 AMIRA와 같은 소프트웨어와 함께 분석할 수 있습니다. </li><li> 프로브 - 수여 형광이 감소하기 시작하기 전에 antifadent에 포함된 슬라이드는 ° C (동결하지 않음) 최대 7 일 동안 4에 저장할 수 있습니다. 또는 antifadent는 ddH 2 O와 제거 수 있으며, 말린 슬라이드는 오랜 기간 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : (고정 orthodontic 기기에서 biofilm을 근근이 살아가고그림 5) 현미경에 대한 코팅 유리 슬라이드에 직접 hybridized 수 있습니다 적합 조각 (그림 6)를 산출. 이러한 방법으로 orobiome 박테리아의 다른 그룹이 다르게 표시된 특정 프로브 (그림 7 및 8)로 태그 세균성 rRNA하여 자연 입체 환경에서 확인할 수 있습니다. 그림 7에서 biofilm은 EUBmix (녹색, 모든 세균)과 LGCmix (노랑, Firmicutes)와 스테인드했습니다. 그들은 노랑, 파랑 물들일 것처럼 Firmicutes은 녹색으로 표시됩니다. 그림 8에서 biofilm은 EUBmix (빨강, 모든 박테리아), Bac303 (파란색, Bacteroidetes)과 POGI (노란색, Porphyromonas의 gingivalis)와 스테인드되었습니다. 세 프로브는 DNA와 중복에 바인딩으로 Porphyromonas의 gingivalis이, 노란 흰색에 표시됩니다 하얀 신호에 색상 결과. 박테리아의 그룹 간의 형태학의 차이는 또한 (그림 9 및 10) 확인할 수 있습니다. coccoid 박테리아의 큰 클러스터는 (녹색, 모든 바 얼룩이 EUBmix로 수행된 그림 9에 표시됩니다cteria). 구강 박테리아의 다른 모양은 coccoid 및 filamentous 박테리아가 EUBmix (적색)와 얼룩으로 구분할 수있다 그림 10에 시각되었습니다. 또한 biofilm의 전형적인 버섯 모양의 구조가 CLSM 데이터의 3D 모델링 (그림 11 및 12)를 통해 처리할 수하면 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">3D 모델링의 동영상을 감상하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 원위치로 맛이 좋은 확장을 수정. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 노라 드라이 필드 시스템. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 펜치, 장갑 및 트레이를 소독. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 확장기를 제거했습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 무균 메스와 biofilm을 근근이 살아가고. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 수지 조각은 직접 코팅 유리 슬라이드에 hybridized. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7 CLSM 이미지 :. 특정 박테리아 그룹의 차별. 3 차원 CLSM 스택 데이터를 2D 오버레이. Biofilm은 EUBmix (녹색, 모든 세균)과 LGCmix (노랑, Firmicutes)와 얼룩. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 8"> 그림 8 CLSM 이미지 :. 특정 박테리아 그룹의 차별. 3 차원 CLSM 스택 데이터를 2D 오버레이. EUBmix (빨강, 모든 박테리아), Bac303 (파란색, Bacteroi과 Biofilm 자국detes)와 POGI (노란색, Porphyromonas gingivalis의). <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 9"> 그림 9 CLSM 이미지 :. 특정 morphologies의 차별화. 3 차원 CLSM 스택 데이터를 2D 오버레이. Biofilm은 EUBmix (녹색, 모든 박테리아)과 얼룩. coccoid 박테리아의 대형 클러스터 (화살표). <img alt="그림 10" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 10"> . 그림 10 CLSM 이미지 : 특정 morphologies의 차별화. 3 차원 CLSM 스택 데이터를 2D 오버레이. Biofilm은 EUBmix (빨강, 모든 박테리아)과 얼룩. Coccoid (아래 화살표)와 filamentous 세균 (위 화살표)를 구별하실 수 있습니다. <img alt="그림 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 11"> 그림 11. 버섯 구조 아래에서 3 차원 전망이 있습니다. EUBmix 및 proce 물들일 biofilm 조각 (orthodontic 어플 라이언 스의 표면 긁어 냈어요)의 스택IMARIS (CLSM 이미지)와 함께 ssed. <img alt="그림 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 11"> 그림 12. 버섯 구조, 3D 측면 볼 수 있습니다. IMARIS (CLSM 이미지)와 함께 처리 biofilm 조각 (orthodontic 어플 라이언 스의 표면 긁어 냈어요)의 스택. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 하이브 리다이 제이션 버퍼 (200 μl) </td></tr><tr><td> 포름 아미드 농도 </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 36 </td><td> 36 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 1 M 트리스 - HCL </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 2퍼센트 SDS </td><td> 일 </td><td> 일 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> FA </td><td> 20 </td><td> 40 </td><td> 90 </td></tr><tr><td>2 O </td><td> 138 </td><td> 118 </td><td> 68 </td></tr><tr><td> 모든 생선 프로브 </td><td> 이 </td><td> 이 </td><td> 이 </td></tr></tbody></table> 하이브 리다이 제이션 버퍼의 표 1. 성분 (μl의 농도). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 세척 버퍼 (50 ML) </td></tr><tr><td> 포름 아미드 농도 </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 4500 </td><td> 2150 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> 1 M 트리스 - HCL </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 0 </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> ddH 2 O </td><td> 44 500 </td><td> 46 350 </td> 48 200 </tr></tbody></table> 세척 버퍼의 표 2. 성분 (μl의 농도). 영화는 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

설명한 프로토콜 계약은 하드 자료의 수집 얼룩 biofilms에 매우 가능한 접근이다. 샘플링과 하이브 리다이 제이션은 가장 중요한 단계입니다. 샘플링 기간 동안주의가 충분한 두께의 조각이 biofilm 구조가 그대로 유지하기 위해 수집되는 이동해야합니다. 하이브 리다이 제이션 동안, 그것은 따라서 찬란 분류 프로브가 아닌 특정 바인딩 또는 바인딩의 손실을 피하고, 온도 과도한 변동을 피하기 위해 필수적입니다. 이 물고기 프로토콜의 구성을 방해하지 않고 직접 유리 슬라이드에 정상적인 이기종 biofilm을 얼룩이 우아한 방법입니다. 슬라이드 바로 다시 샘플을 이동하지 않고 현미경을 위해 사용될 수 있습니다. 이러한 방식으로, 튜브에 얼룩 이상의 개선이 biofilm에 적용되는 더 적은 전단 강제로 이루어집니다. &gt; 50 μm의 두께의 조각이 방식으로 준비하고 조사 수 있습니다.

형광에 원위치 하이브리드화 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 맛이 좋은 확장기의 사정 biofilm 분석

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

자연 이기종 biofilm의 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)은 얼룩 기법, 그들이 원위치 하이브리드화 (물고기)에서 형광되는 하나의 포괄적인 범위로 오늘날 용이합니다. 1,2, 우리는 구강 biofilm 예제는 고정에서 수집하는 파일럿 연구를 수행 orthodontic 가전 (맛이 좋은 확장기)는 생선, 자연 biofilm 및 상패 축적의 3 차원의 조직을 평가하는 목적에 의해 스테인드되었습니다. 3,4 물고기가 찬란 레이블 16를 사용하여 네이티브 biofilm 환경에서 세포를 얼룩 수있는 기회를 만듭니다 rRNA 타겟팅 프로브를. 4-7,19이 immunofluorescent 라벨과 같은 다른 기술에 비해,이 혼합 biofilm의 컨소시엄에서 다른 박테리아 그룹을 조사 저렴, 정확하고 간단 라벨 기법입니다. 18,20 일반 프로브가 사용하는 것을 Eubacteria에 바인딩 ( EUB338 + EUB338II + EUB338III; 이하 EUBmix), 80-10 Firmicutes는 (LGC354 AC;. 이하 LGCmix), 9,10과 Bacteroidetes (Bac303) 11 또한, 연쇄상 구균의 mutans에 바인딩을 특정 프로브 (MUT590) 12,13과 Porphyromonas gingivalis의 (POGI) 13,14 사용되었습니다 . 관련 표면 재료의 극단적인 경도 (스테인레스 스틸과 아크릴 수지)는 biofilm을 준비하는 새로운 방법을 찾는 우리에게 강요. 이러한 표면 물질이 쉽게 cryotome로 잘라 수 없습니다로서, 다양한 샘플링 방법은 그대로 구두 biofilm을 얻기 위해 탐험했다. 이러한 방식을 가장 가능한이 의사 소통에 표시됩니다. biofilm 운반 아크릴 수지의 작은 조각은 biofilm 구조를 손상하지 않도록 돌봐, 무균 메스로 긁어 냈했다. 집게는 철강 표면의 biofilm를 수집하는 데 사용되었습니다. 일단 수집, 샘플은 고정 및 polysine 코팅 유리 슬라이드에 직접 배치했다. 물고기가 프로브 m 이러한 슬라이드에서 직접 수행되었습니다위 entioned. 다양한 생선 프로토콜 결합하여 취급하기가 쉽고 새로운 프로토콜을 만들 수정되었습니다. 5,10,14,15은 이후 샘플을 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 분석되었다. 잘 알려진 구성 3,4,16,17는 버섯 스타일의 형성 및 채널에 의해 줄다리기 coccoid 박테리아의 클러스터를 포함하여, 시각 수 있습니다. 또한, 이러한 전형적인 biofilm 구조의 세균성 조성 분석과 2D 및 3D 이미지는 만들어졌습니다.

우리는 함께 orthodontic 가전 제품에서 자연 구두 biofilm의 구조와 작곡 분석을 위해 프로토콜을 제시<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브 리다이 제이션 (물고기) 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM). 구강 biofilm 샘플들은 표면에 묻은 아크릴 - 수지 조각 근근이 살아가고와 분자 처리를 위해 그들을 추천, 맛이 좋은 확장기에서 수집되었다.

형광에 원위치 하이브리드화 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 맛이 좋은 확장기의 사정 Biofilm 분석

천연 불균질 바이오필름의 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 관찰은 오늘날 광범위한 염색 기법들을 통해 용이해졌으며, 그중 하나는...

이 절차의 전반적인 목표는 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescence in situ hybridization)을 위해 구개 확장 장치로부터 천연 구강 바이오필름을 얻는 것입니다. 우선 구개 확장 장치를 제거하여 환자로부터 4개월 된 바이오필름을 수집함으로써 이를 수행합니다. 그다음, 바이오필름이 포함된 아크릴 수지 조각들을 구개 확장 장치에서 긁어냅니다.그런 다음, 고정된 바이오필름의 C two 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescence in situ hybridization)을 코팅된 슬라이드 위에서 직접 수행합니다. 마지막으로, 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy) P를 사용하여 염색된 바이오필름을 분석합니다. 결과적으로, 형광 인시튜 하이브리다이제이션과 공초점 레이저 주사 현미경을 통해 박테리아 바이오필름 군집의 구조와 조성이 나타납니다. 저희는 육안으로 확인할 수 있을 정도로 교정용 확장 장치에 두껍게 형성된 바이오필름을 발견했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다.연구진은 이들과 치주 질환 사이의 가능한 연관성에 대해 고찰하였습니다. 이 방법은 구강 내 자생적 바이오필름의 공간적 배열 및 구성과 같이 구강 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 학제 간 연구이며 서로 다른 분야의 전문가들에 의해 수행되어야 합니다.먼저, 엘리자베스는 치과 교정 전문의이고 바바라는 분자 생물학 연구원입니다. 구강 내 표면을 4개월 동안 처리한 후, NOLA dry field 시스템을 사용하여 고정식 구개 확장 장치를 격리하여 오염을 방지합니다. 멸균된 플라이어, 장갑 및 트레이를 사용하여 환자의 입에서 장치를 제거합니다.시료를 120 mL 바이알에 담아 -20 °C에서 보관하십시오. 실험실로 운반할 때는 얼음에 넣어 이동하고, 24시간 이내에 처리하여 표본을 고정하십시오. 멸균 메스로 바이오필름 조각을 긁어내거나 멸균 포셉으로 조각을 수집하십시오.바이오필름 구조가 얼음처럼 차가운 상태에서 온전하게 유지되도록 적절한 두께의 아크릴 수지 조각을 긁어내는 것이 중요합니다. 샘플이 충분히 덮일 때까지 4% paraldehyde 용액을 넣습니다. 이 혼합물을 4 °C에서 3~12시간 동안 배양합니다.고정 시간이 길어지거나 고정 온도가 높으면 그람 음성균의 세포 외피가 올리고뉴클레오타이드 프로브에 대해 덜 투과적으로 변할 수 있습니다. 배양 후, 파라알데히드 용액을 제거하고 ice cold 1× PBS로 세척합니다. 잔류 파라알데히드를 제거하기 위해 이 단계를 2~3회 반복합니다. 샘플을 ice cold 1× PBS 1부피로 현탁한 후, ice cold 96% ethanol 1부피를 추가하여 샘플을 -20 °C에서 보관합니다.시료를 탈수시키기 위해 수개월에서 수년 동안 보관할 수 있습니다. 먼저, 파라알데히드로 고정된 시료 물질 5~30 µL를 현미경 슬라이드에 도포합니다. 리소자임과 포름알데히드가 세포벽을 부분적으로 분해하는 동안, 46 °C에서 15분 동안 또는 실온에서 더 오래 시료를 건조시킵니다.프로브의 침투력을 높이기 위해 1 mg/mL lysozyme 용액 250 µL를 첨가하여 실온에서 10분 동안 처리한 후, 슬라이드를 50%, 80%, 96% ethanol에 각각 3분씩 담급니다. ethanol 농도 구배에 의한 탈수 효과는 막을 붕괴시켜 oligonucleotide 프로브의 흡수를 촉진합니다. 마지막으로, 슬라이드를 46 °C에서 건조한 후 in situ U hybridization을 수행합니다.먼저 1 mL의 신선한 하이브리다이제이션 버퍼를 준비하여 47 °C로 예열합니다. 올리고뉴클레오타이드 프로브 용액을 얼음 위에서 해동하고 빛으로부터 차단하여 보관하십시오. 정사각형 페트리 접시에 티슈 페이퍼 한 장을 놓고, 하이브리다이제이션 버퍼 800 µL를 티슈 페이퍼 위에 피펫으로 분주합니다.버퍼에 formamide가 포함되어 있으므로 즉시 챔버를 다시 닫으십시오. 나머지 하이브리드화 버퍼 200 µL에 각 프로브 2 µL를 추가합니다. 잘 섞어준 후, 현미경 슬라이드 위의 탈수된 샘플에 혼합물을 도포합니다. 즉시 슬라이드를 디쉬에 수평으로 놓은 후 덮개를 덮습니다. 디쉬를 오븐에서 46 °C로 1~5시간 동안 배양합니다.이 디시는 슬라이드에서 하이브리다이제이션 용액의 증발을 방지하는 습도 챔버 역할을 합니다. 특히, form amide의 증발은 비표적 세포에 대한 프로브의 비특이적 결합을 유발할 수 있습니다. 세척 완충액 50 milliliters를 준비하고 항온수조에서 48 degrees Celsius로 예열하십시오.슬라이드가 담긴 접시를 하이브리다이제이션 오븐에서 꺼냅니다. 즉시 소량의 예열된 세척 버퍼로 하이브리다이제이션 버퍼를 씻어내고, 슬라이드를 나머지 세척 버퍼로 옮깁니다. 세척 버퍼와 슬라이드가 들어 있는 튜브를 다시 항온수조에 넣고 48 °C에서 10~15분 동안 인큐베이션합니다.두 개 이상의 프로브로 시료를 염색하려면, 세척 버퍼를 제거한 후 이전 단계들을 반복하십시오. 이때 가장 높은 농도에서 낮은 농도 순으로 진행하도록 주의하십시오. 튜브에서 슬라이드를 꺼내 얼음에 담급니다.차가운 2중 증류수로 2~3초 동안 세척합니다. 잔류 세척 버퍼를 제거하기 위해 슬라이드를 최대한 빠르게 공기 건조시키십시오. 빠르게 건조할수록 프로브 해리가 감소합니다.건조된 슬라이드는 -20 °C의 암소에 보관하며, 프로브에 의한 형광 신호의 유의미한 손실 없이 수 주 동안 보관할 수 있습니다. 샘플을 이미징하려면 Antifa 시약 두 방울을 슬라이드의 좌우 끝부분 근처에 떨어뜨린 후 커버 슬립을 덮습니다. 적절한 필터나 레이저가 장착된 공초점 레이저 주사 현미경으로 샘플을 관찰하며, 슬라이드는 4 °C에서 최대 7일 동안 보관하거나, 이중 증류수로 세척 후 -20 °C에서 더 오랜 기간 보관할 수 있습니다.고정식 교정 장치의 바이오필름을 촬영한 것입니다. 코팅된 유리 슬라이드에 직접 하이브리드화하여 현미경으로 관찰할 수 있는 적절한 플레이크를 얻을 수 있으며, 특정 프로브를 통해 세 가지 입체 구조의 세균을 포함한 다양한 구강 마이크로바이옴 그룹을 식별할 수 있습니다. 이 그림에서 바이오필름은 EUB 믹스와 LGC 믹스로 염색되었으며, 노란색과 파란색으로 염색된 것들에 비해 녹색으로 나타나는 뚜렷한 입자들이 보입니다.여기서 바이오필름은 EUB mix back 3 0 3 및 pogi로 염색되었습니다. bacteria dts 그룹의 박테리아는 분홍색과 poor fire로 나타납니다. Ramons gingivalis는 세 가지 프로브가 모두 해당 DNA에 결합하고 색상이 겹쳐 흰색 신호가 나타나므로 황백색으로 표시됩니다. 형태학적.박테리아 그룹 간의 차이점뿐만 아니라 구균(coco bacteria)의 거대 군집과 같은 특정 구조 또한 식별할 수 있습니다. EUB mix를 사용하여 염색한 이러한 군집의 예가 여기에 표시되어 있습니다. 또한, CLSM 데이터의 3D 모델링을 통해 바이오필름의 전형적인 버섯 모양 구조를 처리할 수 있습니다.이것은 EUB 혼합 염색 바이오필름의 3D 애니메이션입니다. 이 방법은 교정 치료로 인해 유도된 바이오필름 형성에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 잠재적 병원성을 가진 복잡한 바이오필름 구조를 형성하는 인체 내의 다른 모든 인공 표면에도 적용할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 형광 인시튜 하이브리다이제이션(FISH) 및 공초점 레이저 주사 현미경 관찰을 위한 천연 구강 바이오필름 준비 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 분야는 학제 간 연구 분야이므로 팀원들과 협력해야만 성공할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 그러므로 항상 동료들을 친절하게 대하시기 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

치아 표면에 형성 Biofilms는 매우 복잡하고 그들의 아키텍처를 조절 상수 타고난 및 외인성 환경 문제, 생리 및 transcriptome에 노출되어 있습니다. 우리는 조성, 구조 조직 및 biofilm 연구의 다른 분야에 적용할 수 있습니다 경구 biofilms의 유전자 발현을 검사하는 도구 상자를 개발했습니다.

구강 Biofilms의 종합, 생물 구조 및 Transcriptome 평가를위한 분석 도구 - 상자가 Mutans Streptococci의 중재

출처: 테이, S. B., et.al. 조작된 쿼럼 소환 락토나제를 이용한 병원성 바이오필름의 항병원성 파괴.  J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 박테리아 세포 신호를 교란하는 효소를 도입하여 바이오필름 형성을 억제하는 과정을 보여줍니다. 이 효소는 박테리아가 세포외 고분자 물질을 생성하는 것을 막아, 유리 바닥 마이크로디시에서 바이오필름 발생을 감소시킵니다. 마지막으로, 형광 렉틴과 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 바이오필름 구조를 시각화합니다.

효소 매개 바이오필름 형성 억제의 현미경 평가

이 동영상은 pH 민감성 비율계량 프로브를 사용하여 치과 생물막의 세포 외 pH를 모니터링하기 위한 실시간 분석을 보여줍니다. 현장에서 성장한 박테리아 생물막이 포도당에 노출되면 박테리아 바이오매스 근처의 세포 외 pH가 감소하여 프로브가 양성자화되어 박테리아 내부의 농도가 증가합니다. 양성자화된 프로브와 양성자화되지 않은 프로브 사이의 방출 파장의 차이는 생물막의 세포외 기질에서 pH를 계산하고 시간 경과에 따른 pH 변화를 추적하는 데 사용됩니다.

치과 생물막에서 세포 외 pH의 실시간 모니터링을 위한 분석

생물막 내 3개의 세포 및 세포 외 구성 요소를 동시에 정량화하고 비교하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법론에는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경, 생물막 구조 분석 및 시각화 소프트웨어, 통계 분석 소프트웨어의 사용이 포함됩니다.

생물막의 세포 및 세포 외 성분의 동시 정량화

이 방법 용지의 목적은 일반적으로 인간 치은 연상 치석에서 식별 종을 포함 멀티 종 생물막의 개발을위한 마이크로 유체 시스템의 사용을 설명하는 것이다. 방법은 생물막 구조, 생물막 생존 및 강조 표시됩니다 문화에 의존 또는 문화 독립적 인 분석을위한 수확 바이오 필름에 대한 접근을 설명한다.

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

pH 민감성 염료 비율 적 실시간 치과 생물막의 세포 외 pH를 모니터링하는 공 초점 레이저 주사 현미경, 디지털 화상 분석과 조합하여 사용된다.

치과 바이오 필름에 세포 외 pH를 비례 영상

이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

어린 시절 내내 구강 미생물에 변화는 성장 하는 관심사의 이다. 다른 미생물 연구의 비교는 표준화 된 샘플링 프로토콜의 부족을 보여준다. 제한 된 공간 샘플링 어려운 이들의 사운드 subgingival 고 랑을 만든다. 종이 포인트 샘플링은이 지역에 대 한 선택의 방법으로 자세히 여기 표시 됩니다.

건강 한 아이에서 미생물 분석을 위한 구두 Biofilm 샘플링

여기, 선물이 세균성 세포 생존 및 형태학 상 특성의 분석을 포함 하 여 치과 보 철물 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 구두 biofilm 형성 평가 하는 프로토콜. 현장에서 모델 관련 강력한 현미경 검사 법 기술 된 구두 biofilm 분석에 사용 됩니다.

치과 임 플 란 트에 대 한 다른 자료에 구두 Biofilm 형성

이 프로토콜은 칸디다 알비칸스와 연쇄상 구균 뮤탄으로 구성된 크로스 킹킹 바이오필름의 재배를 설명하고 이러한 생물막 내부의 세포외 pH 모니터링을 위한 공초점 현미경 기반 방법을 제시한다.

공초점 현미경을 사용하여 크로스 킹덤 생물막에서 세포 외 pH 모니터링

이 프로토콜의 목표는 다양한 분자 크기의 형광 표지된 덱스트스트란을 생 체 내 치은염 표면에 국소적으로 도포한 후, 단일 광자 현미경 시스템을 이용한 체외 영상을 통해 쥐 치은상피 장벽의 무결성을 정량적으로 평가하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다.

형광 추적체를 이용한 마우스 치은성 상피 장벽의 기능 평가

배우세요 형광 원위치 하이브리드화와 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 교정용 확장기에서 구강 바이오필름을 분석하는 방법을. 이 기술은 구강 미생물학 연구와 치주 질환 관계 이해에 활용됩니다.

형광에 원위치 하이브리드화 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 맛이 좋은 확장기의 사정 Biofilm 분석

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