Name: 의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster의 안테날 엽에서 냄새 유발 칼슘 반응을 광학 이미징으로 측정하는 방법을. 이 기술은 후각 신경의 시공간 활동 패턴을 시각화하여 신경 과학 연구에 활용됩니다.

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우리는이 방법론, 그림 1에 도식의 사용을위한 마운트 블록 청사진과 다니엘라 Pelz를 그리기위한 파블로 Traversa의 개발에 Silke Sachse와 비테 Eisermann을 인정합니다. 우리는 Silke Sachse, Pavan Ramdya 및 원고에 대한 덧글에 대한 라파엘 Rytz에 감사합니다. R. 벨은 Boehringer Ingelheim 재단 박사 학위 원정대에 의해 지원됩니다. R. 벤톤의 연구실에서 연구는 독립적인 연구원 그랜트와 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)을 시작하는 유럽 연구 협의회에 의해 후원된다.

1. 마운팅 블록 어셈블리 <ol><li> 플렉시 글라스 장착 블록 (그림 1A)을 (에서 제공하는 청사진에 주어진 정확한 사양에 제출하여야한다 <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> ) 파리 쉽게 장착과 절개를 허용합니다. 뒤쪽에서 나사를 통해 스레드하지만 블록의 전면 넘어 그들을 연장하지 않으며 그들의 위치는 (2.7 참조​​) 동물의 준비 기간 동안 조정됩니다. </li><li> 정밀 드릴 사용하면,이 시점에서 블록의 두께를 줄이고, 파리의 시체를위한 공간을 만들기 위해 표면 아래 파고, 파리에 대한 원형 챔버의 위쪽 테두리의 발전을합니다. </li><li> 메스 직각으로 구리 격자를 잘라 "칼라"를 만들기 위해 슬릿의 하단으로 닫습니다. 이것은 파리의 삽입을하는 데 도움이되므로 두 가지 결과로 펄럭는 레벨 있는지 확인합니다. </li><li> 이쑤시개로 플라이를위한 순환 챔버 위의 마운팅 블록쪽으로 superglue의 작은 방울을 넣으십시오. 슬릿이 블록 (그림 1A)를 중심으로되도록 접착제와 위치를 향해 구리 그리드를 배치합니다. 부드럽게 아래로 눌러 초과 접착제를 제거하십시오. 족집게 한 켤레로, 각 측면에 펄럭 아래 접착제의 작은 방울을 추가하고 슬릿 바로 아래쪽 포인팅되도록 블록의 앞면 위에 격자를 접으십시오. 그리드의 맨 위에는 블록과 수준에 있는지 확인하십시오. 완전히 건조하도록 허용합니다. </li><li> 전선 홀더 조립 : 하프 플라스틱 coverslip을 생략하고 "U"모양을 만들기 위해 중앙 조각을 제거합니다. "U"의 맨 위에 접착제 철사 한 조각으로 밀랍을 사용하여, 와이어가 너무 긴장하지 않습니다. </li><li> antennal 방어막을 구축 : 종이 구멍 펀치와 플라스틱 coverslip에 구멍을 확인하십시오. 0.5 X 0.7 cm로 coverslip의 가장자리를 트림. 접착제 후 피어싱 플라스틱 끈적끈적한 테이프로 coverslip하고 구멍을 통해 노출된 테이프에 대한 에탄올의 방울을 배치접착제를 제거합니다. </li></ol> 2. 동물 준비 <ol><li> 해당 유전자형의 파리 - 즉, "드라이버"와 활동 기자 transgenes의 원하는 조합을 베어링 - 1~3주 이전이어야합니다; 젊은 파리의 표피 컷이 너무 부드럽고 어렵습니다. 실험, 그리고 transgene 표현 수준을 일치하기 위해 여러 genotypes의 직접적인 비교가 필요하면, 파리는 연령과 관련된 생리적 차이를 피하기 위해 나이와 일치해야합니다. 성별은 중요하지 않다면, 우리는 그들이 더 큰 머리를 가지고 있고 조작하기 쉬운이기 때문에 여성의 파리를 사용하는 것을 선호합니다. </li><li> 얼음에 냉각에 의해 파리를 마취. </li><li> 마운팅 블록에 단일 플라이를 소개합니다. 날개 공동으로 파리를 잡고 밀어, 구리 격자의 슬릿을 따라 첫번째 지느러미 - 표면, 그것은 그것의 목 (그림 1B-C)에 의해 정지되어 있도록. 필요한 경우는 아래를 내려다 보면서 때까지 그것을 돌린다. </li><li> F 앞에서 훌륭한 선인장 척추를 놓으십시오(그림 1B-C) 이스케이프하지 않도록 요의 머리. 이동하지 않도록 코 앞에 선인장 척추를 놓습니다. 밀랍을 사용하여 블록 선인장 척추를 고정한다. 머리의 상단이 블록의 맨 위에있는 수준인지 확인합니다. </li><li> 로진의 작은 방울 (에탄올에 용해)로 블록 플라이의 머리를 고정한다. humidified 상자에 블록을 놓고 약 1 시간 단단해에 로진하실 수 있습니다. </li><li> 안테나와 머리 사이 cuticular 배 안에, 집게를 사용하여 홀더 (1.5 참조 왁스 - 사이드 아웃)에 와이어를 앞으로 antennal 접시를 뽑아 놓습니다. 밀랍으로 블록의 전면에 홀더를 고정한다. </li><li> 블록에 내장된 나사를 사용하여 부드럽게 antennal 판과 머리 사이 공간을 만들어야 앞으로 와이어 홀더를 밀어. </li><li> 중앙 위치에 구멍 파리의 머리의 맨 위에 antennal 실드를 (1.6 참조) 놓습니다. 장착 블록의 상단에 밀랍으로 수정합니다. </li><li> 블레이드 - 스플리터, 세제곱 사용방어막에 대한 테이프의 타 작은 구멍은 안테나 뒤에 파리의 머리 표피를 노출. 구멍가 새는에서 준비를 방지하기 위해 눈을 넘어 확대해서는 안됩니다. </li><li> 두 구성 요소 실리콘으로 테이프와 표피 사이에 구멍을 밀봉합니다. 파리의 머리 위로부터 초과 실리콘을 제거합니다. </li><li> 한 방울을 배치 Drosophila 울리는의 머리에 (130 MM NaCl, 5 KCl 밀리미터, 2 밀리미터 MgCl 2, 2 MM CaCl 2, 36 MM 이당류, 5 밀리미터 HEPES, 산도 7.3) 염분. 안테나 완전히 건조 남아 있어야합니다 전혀 누수가 없는지 확인합니다. 사파이어 블레이드를 사용하여 표피에 구멍을 했네요. 첫째, 가볍게 직접 안테나 뒤에 cuticular 배를 따라 점수는 다음 뒷면에 눈을 따라와 ocelli 전역 했네요. 마지막으로, 득점 끄트머리로 표피의 조각을 접어 antennal 신경을 severing 피하기 위해 아래쪽에서 했네요. </li><li> 조심스럽게 고급 핀셋으로 분비 및 호흡 관을 제거하십시오. Drosophila와 반복 린스 </li></ol> 3. 냄새 자극 배달 <ol><li> 악취 주사기가 : 총신 깊숙히 패드를 밀어 피펫 팁을 사용, 적절한 용매에 원하는대로 희석 분출 깨끗한 포셉 및 피펫 (필터 팁 사용) 악취의 20 μl로 2 ML 플라스틱 주사기로 셀룰로스 패드를 삽입 . 플러그 앤 캡 주사기가 필요 때까지. 적어도 3 개월 (혹은 더 자주 높은 휘발성 및 / 또는 자주 사용하는 악취의 경우) 신선한 냄새 dilutions도 미리 알고 있어야하고, 새로운 패드 단지 각각의 녹음 세션 전에 악취 주사기 준비되어야한다. 악취 농도가 가옥 수 있기 때문에보다 3 stimulations에 대한 악취 패드를 사용하지 마십시오. </li><li> 사용자 정의 만든 olfactometer (그림 2) : 주 공기 흐름은 (1 L / 분) 테플론 튜빙 (0.4 mm 내경)를 통해 이동되며 상류 이러한 튜브의 출구, 보조 공기 흐름 (1 L / 분 27cm ) 추가됩니다. 두 공기 흐름은 멤브레인 펌프에 의해 생성하고있다유속은 두 개의 독립적인 유량계에 의해 규제됩니다. 주의가 필요하다 (예 : ~ 60 분의 1 이상) 이상 - 가습을 피하기 위해 복용해야지만 에어 스트림, 가스 세척 병의 물을 통과하여 humidified 될 수 있습니다. 보조 공기 흐름은 악취 주사기 또는 빈 주사기를 통해서 이동됩니다 : 주사기는 플런저를 피어싱 주사기 바늘 (1.2 mm 외경)를 통해 공기 흐름으로 연결됩니다. 밸브 컨트롤러 장치 (예 : 하버드 기기 VC6)를 통해 제어되는 세 방향 마그네틱 밸브는 깨끗한 공기와 악취 자극 사이를 전환하는 데 사용됩니다. </li></ol> 4. 생체내 이미징에 <ol><li> 우리는 20x 수질 목표 (예 : 자이스 혈구 W "플랜 - 고차 색지움"20x / 1,0 M27 DIC) (그림 2)이 장착된 수직 형광 현미경 (예 : 똑바로 고정 무대 자이스 혈구 Axio 심사관의 D1)를 사용하여 여기에 이​​미징에 대해 설명합니다. G-CAMP (여기 / 방출 : 509분의 488 nm의)와 영상 내용 : 450-490 나노미터 여기 필터, 다음과 같은 특성을 가진 필터 블록을 사용, 이색성 거울 (T495LP) 및 500-550 nm의 방사 필터 (채도 동부 표준시). 현미경 플라이를 포함하는 마운팅 블록을 배치합니다. 파리의 안테나 앞 olfactometer 약 0.5 cm의 출구를 둡니다. </li><li> 그것은 파리의 머리에 울리는의 솔루션을 감동까지 목적을 낮춥니다. 머리 캡슐의 구멍은 중심과 국경 초점에되도록 밝은 - 그라운드 조명 하에서, 위치 준비를 뷰어를 통해 찾고. 당신이 표시된 뉴런을 (G-CAMP의 기저 녹색 형광의 명백한)을 볼 수까지 형광등으로 전환하고 초점을 조정합니다. </li><li> 전하 결합 장치와 이미지를 인수하여 관심 glomeruli에 파인 초점 (CCD) 카메라 (예 : CoolSNAP-HQ2 디지털 카메라 시스템) 적절한 수집 소프트웨어 (예 : Metafluor) (그림 3A)를 사용하는 현미경에 장착. 몇 군데 지역에 여기 광을 제한하기 위해 조명 광 경로에 격막을 닫습니다. </li><li> 냄새 evoked 녹음활동 4 Hz에서로 획득 률을 설정하고 CCD 카메라의 동적 범위 내에서 형광 값을 얻을 노출 시간을 조절하지만, 적어도 12 비트 다이나믹 해상도 1000 (임의 단위)보다 낮은 않습니다. 노출 시간은 G-캠프 photobleaching을 줄이기 위해 가능하면, 100 MS를 초과해서는 안됩니다. 카메라의 공간적 해상도가 허용하는 경우에는 노출 시간을 줄이기 위해 (한 디지털 픽셀로 binned됩니다 칩 우물의 수) binning을 높일 수 있습니다. 우리는 준비에서 210x135 μm의에 해당하는 350x225 픽셀 (2x2의 binning과)의 이미지를 구하십시오. 이러한 설정은 표백 기자를 제한하면서 좋은 공간과 시간적 해상도로 G-CAMP의 사구체 악취 유발 응답을 캡처할 최적입니다. </li><li> 측정 매개 변수를 설정합니다. 우리는 일반적으로 악취 자극 일반적으로 인수 기간의 시작 후에 사초를 시작 (프레임 15) 지속적인 일초 (U로, 10 초 (즉, 40 프레임)에 대한 기록ntil 프레임 19). 플라이 준비는 보통 흔히 photobleaching으로 인해 기자의 형광 신호에 돌이킬 수 감소에 의해 제한 25-30 다른 악취 자극에 함께 테스트할 수 있습니다. 상호 자극 간격은 관찰 응답의 강도와 photobleaching의 속도에 따라 달라집니다. 감각 적응을 피하기 위해 상호 자극 간격의 적절한 길이를 시범 실험에서 긍정적인 제어 냄새 (알려진 경우)의 반복적인 프레 젠 테이션에 의해 약 확인할 수 있습니다. 이 냄새의 포함은 주어진 일련의 모든 ~ 10 자극의 지속적인 생존 능력과 준비의 일관된 반응의 확인을 허용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 데이터 처리 및 분석 데이터는 ImageJ (맥 biophotonics 플러그인과 함께 사용하여 처리 <a href="http://www.macbiophotonics.ca/">www.macbiophotonics.ca</a> )와 다음과 같이 Matlab 및 R에서 사용자 지정 작성된 프로그램 : <ol><li> 샘플 운동 구조물에 정정 :StackReg / TurboReg의 "단단한 몸"모드 (사용하는 늑대가 준비 (예 : 40 프레임 각각의 30 측정)에 해당하는 모든 이미지 정렬 <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg">bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg</a> ImageJ에이). 이 단계는 측정 이내 사이의 인수 프레임에 관하여 레이블 뉴런의 위치에 변화를 제거하는 데 필요합니다. 그러나, XY 평면의 변화을 없애야 가능합니다. 초점의 강력한 변화가 발생할 경우 데이터는 폐기되어야합니다. </li><li> 개별 (40 프레임) 10 초 측정에 세그먼트 스택을. </li><li> 유물 표백을위한 올바른 : 형광등 불빛에 노출은 하나의 측정 10시 가옥하는 형광하게됩니다. 어떤 경우에는 그것은 데이터를 분석하기 전에이 부패에 대한 정정하는 것이 중요합니다. 각 측정 배경 프레임을 계산합니다. 이것은 자극 증상 (예 : 프레임 6-14) 이전에 여러 프레임의 평균 있어야합니다. 이 backg하여 각 프레임 나누기상대 형광 변화를 얻기 위해 프레임을 높이 들어라. G-CAMP에 의해 표시된 영역 내의 모든 픽셀을 평균하여 각 프레임에 대한 평균 상대 형광 값을 계산합니다. 악취 응답 (20 프레임의 경우 자극 증상 이후)의 시간 부양과 제로 체중 전에 프레임에 강한 무게를 준다 평균 형광 커브에 두 지수를 장착. 각 픽셀의 상대 형광 곡선에서 장착되어 커브를 뺍니다. 원시 데이터를 다시 얻을 배경 프레임에 의해 수정된 프레임을 곱하면됩니다. 신호 측정의 끝 (억제 또는 아주 강한 흥분성의 응답 evoked하는 경우 예) (그림 4)에 의해 기준에 반환하지 않는 경우 정정의 이러한 종류의 응답 역학의 변형을 초래할 수 있습니다. 표백 유물의 수정이 많은 경우에 유용하지만 표백 정정이 적용되는 경우, 시간적 매개 변수의 해석은주의하여야한다. </li><li> 형광의 상대적인 변화를 (&amp; 드 계산lta, F / F) (각 측정의 각 프레임에 대한 F, I, F 0) / F F 0의 I 번째 프레임에 대한 나도 형광 값 배경 프레임 (5.3 참조), 그리고 F는 0 * 100, 측정. </li><li> 활동 흔적 (그림 5A)을 구하는 10 개의 픽셀의 직경 glomerulus (그림 3B)에 대한 관심의 원형 지역 내의 평균 ΔF / F를 계산합니다. 원하는 경우 ImageJ를 (그림 5A)를 사용 heatmaps로 이들 성분을 변형. </li><li> 응답의 피크시 평균 ΔF / 네 프레임의 F에서 자극 전 평균 ΔF / 네 프레임 F를 빼는 방법으로 응답의 피크 진폭을 계산합니다. 동일한 절차는 공간적 응답 패턴을 (그림 3B 참조) 설명하고 (그림 5B 참조) 파리 전역의 관​​심을 특정 지역에서 응답 진폭을 계량하는 데 모두 사용됩니다. 피크 응답도 자극 시간, 또는 averagin 동안 곡선 아래의 영역을 통합하여 계량하실 수 있습니다응답의 최대 주변 G는 프레임. </li></ol> 6. 대표 결과 우리는 OSNs 29,30 여러 가지 인구 (년 활성 후각 공동 수용체 IR8a을 위해 발기인의 통제하에 G-CaMP1.6 28 표현 파리 프로피 온산-evoked 응답을 기록하고 분석할 위의 프로토콜을 사용 피규어 3-5). 1퍼센트 프로피 온산과 자극은 G-캠프 형광의 증가를 elicits - 세포 내 칼슘의 증가를 나타내는 - 두 glomeruli, DC4 및 DP1l (그림 3B)를 innervating OSNs에. 온라인 활동을 추적, heatmaps 및 피크 반응 바 줄거리 : 우리는 그림 5에서 여러 파리에서 데이터를 표현하는 다양한 방법을 설명합니다. 프로피 온산-evoked 응답 DC4와 DP1l의 뚜렷한 피크 amplitudes와 현세의 역학 있습니다. 반응은 일반적으로 강력한 있지만 또한, 개별 동물 사이의 다양성도 (자신을 볼 glomeruli 모두에서 볼 수 있습니다그림 5A에서 atmaps). 정상 반응 (그림 5B)의 부량은 동물 전반에 걸쳐 다양한 glomeruli하고 다른 odorants 간의 간단한 통계적 비교를하실 수 있습니다. 그러나, 냄새 evoked 칼슘 반응은 비 균일 현세의 역학을 가질 수 있으며 하나의 값으로 자신의 진도를 quantifying하면이 복잡성을 무시합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 마운팅 블록의 도식 파리의 도입, 그리고 클로즈업의 (C) 상단보기 (31에서 적응) () 이전 (B) 후. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 실험 설정의 도식. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 단계 2.8 (왼쪽 패널)와 앤티의 원료 형광 이미지 후에 플라이 준비 () 톱보기nnal 엽 (叶)은 G-CaMP1.6 (; : G-CaMP1.6 : IR8a업자 UAS GAL4 유전자형)으로 표시. DC4와 DP1l glomeruli는 각각 그들의 형태, 크기와 위치에 의해 구분할 수 있으며, 빨간색과 파란색으로 표시됩니다. 프로피 온산 (1 % V / V)에 대한 응답의 (B) 색상 코딩된 이미지입니다. 이미지는 (또한 그림 5A 참조) 단계 5.6에 설명된대로 계산 응답의 피크의 ΔF / F에 해당합니다. 왼쪽 colorscale는 %의 ΔF / F 값을 나타냅니다. 검은 동그라미는 (그림 5 참조) 응답을 계량하는 데 관심있는 지역의 위치와 크기를 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 형광 기자 신호의 표백 수정. 5.3 단계에서 설명한대로 표백제 보정의 효과의 예. 왼쪽 패널에있는 샘플 데이터는 응답의 형태의 주요 변경없이 수정하실 수 있습니다. 오른쪽 패널에있는 샘플 데이터는 심각하게 영향을 미치지 않습니다가능성 표백제 보정에 의한 에드 신호가 떨어지고 냄새 자극 종료 후 기준 이하로 유지되기 때문입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 5 (A) 탑 :. glomeruli DC4 (왼쪽)와 DP1l (오른쪽) 프로피 온산 (1 % V / V)에의 칼슘 반응의 시간적 역학. 검은 흔적은 8 동물에 걸쳐 관심 영역 (그림 3B 참조) 내에서 평균 ΔF / F의 평균을 보여줍니다. 회색 표면은 배포판의 첫번째와 세번째 quartiles 사이의 범위를 나타냅니다. 중앙 분리대 및 quartile 가치 프레 젠 테이션은 평균과 표준 에러보다 다양성과 관찰된 응답의 분포에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 녹색과 마젠타 박스는 프레임이 그림 3B에 표시하고, 그림 5B 논리적으로 양이 정상 응답을 계산하기 위해 평균 나타냅니다. 하단 : heatmaps은 ΔF / F 값을 repr과 함께 별도의 행에있는 모든 개별 동물에 대한 응답 데이터를 표시colorscale (맨 오른쪽)에 의해 esented. 수평 검은 막대가 자극의 시간과 기간을 나타냅니다. (B) DC4와 DP1l glomeruli위한 8 개의 동물에 걸쳐 프로피 온산에 언 피크 반응. 오차 막대는 배포판의 첫번째와 세번째 quartiles 사이의 범위를 나타냅니다.

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

여기에 설명된 준비와 분석 방법은 해당 드라이버 transgene 사용할 수있는 antennal 엽 (OSNs, 종이 및 PNs)에서 뉴런의 인구 냄새 evoked 응답을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 형광 현미경을 사용하여 응용 프로그램을 설명하는 동안,이 준비 광학 이미징은 동일 공촛점 또는 두 개의 광자 현미경 22,32을 사용하여 수행할 수 있습니다. 사실, 이러한 후자의 악기 뉴런 Express의 특히 많은 수의 기자, 이미지의 해상도를 줄일 수 있습니다 와이드 필드 현미경의 광 산란 문제를 완화. 이러한 준비는 보통 50 이상의 시간 동안 냄새 evoked 응답 녹음을 허용하지만, 이번 기록 측정의 수와 길이에 따라 크게 길거나 짧게 될 수 노출 시간은 각 프레임과 상호 자극 간격에 사용. 또한, 두 광자 여기는 형광 기라으로 photobleaching 줄일 수 있습니다orter뿐 아니라 세포 phototoxicity는 긴 시간대 22,32 걸쳐 측정을 허용합니다. 에 관계없이 현미경의 선택, 헤드 캡슐 내에 파리 두뇌의 움직임이 가장 회귀 문제가있을 때 그대로 동​​물의 이미지. 움직임 보정이 사소한 문제 (단계 5.1) 수정할 수 있지만, 그것은 일반적으로 더에만 매우 안정 대책에서 레코드입니다. 운동 유물을 줄이기위한 전략은 다음과 같습니다 :은 (i) 제대로 선인장 척추와 플라이의 코를 constraining, (ii) 본 eicosane (사전 2.6 단계) (eicosane는에서 용해 수와 함께 무대로 고정하여 파리의 다리를 immobilizing ~ 37 ° C는,이 목적을 위해 납땜 인두)의 끝부분을 확장하고 수정 실버 와이어를 사용하지 않습니다 (3) 고급 핀셋으로 식도를 (antennal 신경 사이에 보이는) nicking. 여기에 사용된 G-CaMP1.6 외에도 G-CAMP 및 기타 칼슘 지표의 최적화된 버전의 숫자가 가능합니다그들의 신호 대 노이즈 비율, 기본적인 형광과 측두엽 역학 12,28,33에있는 다릅니다. 센서의 정확한 선택은 계정에 이러한 속성의 모든 뉴런의 유형이 분석되어야하고, 생물 학적 문제가 해결되는 정도 소요됩니다. 전류 센서는 그대로 파리의 신경 활동과 광학 이미징의 잠재력을 향상시키기 위해 지속적으로 특정 유전 드라이버 라인을 35 증가와 결합 행동 잠재력 12,34, 그들의 추가적인 개선과 함께 꽤 ​​잘 상관 관계 칼슘 변경을보고합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 공급 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 선인장 척추 </td><td> 가든 센터 </td><td></td><td> 너무 유연하지 ~ 7mm 긴 얇은 </td></tr><tr><td> 로진 </td><td> 문자열 악기 상점 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 두 구성 요소 실리콘 </td><td> WPI </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> 사용자는 플렉시 글라스 장착 블록을 만들 </td><td> 에서 제공하는 청사진 <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 구리 격자 </td><td> 아테나 격자 </td><td> G220-5 </td><td> 일반적으로 전자 현미경 표본을 위해 사용됩니다. </td></tr><tr><td> 나사 </td><td> 철물점 </TD&gt; <td></td><td> 2mm 직경 </td></tr><tr><td> 플라스틱 coverslips </td><td> 렌즈가 종 </td><td> L4193 </td><td> 22 X 22mm </td></tr><tr><td> 납땜 인두 팁 </td><td> 콘라드 전자 </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> 규제 전원 공급 장치 </td><td> 콘라드 전자 </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> 얇은 철사 </td><td> Isabellenhütte </td><td> ISA-옴 </td><td> 0.013 mm </td></tr><tr><td> Eicosane </td><td> 시그마 </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> Axioexaminer의 D1 </td><td></td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> 수집 소프트웨어 </td></tr><tr><td> 단색 화 </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> 깨뜨릴 수있는 블레이드 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> 블레이드를위한 홀더 </td><td> WPI </td><td> 14,134 </td><td></td></tr><tr><td> 사파이어 블레이드 </td><td> WPI </td><td> 500,314 </td><td> 더블 블레이드 1mm를 깨끗 </td></tr><tr><td> 멤브레인 가스 펌프 </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> 사파이어 블레이드 홀더 </td><td> WPI </td><td> 500,317 </td><td></td></tr><tr><td> 세 방향 밸브 </td><td> 리 회사 </td><td> LFAA1200118H </td><td> 구성 E </td></tr><tr><td> Rotameter 500 ML / 분 </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotameter 5 L / 분 </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> 밀랍 </td><td> Siladent Technik </td><td> 209,212 </td><td>; </td></tr><tr><td> 셀룰로스 패드 </td><td> Kettenbach 의료 </td><td> 31,003 </td><td></td></tr><tr><td> 족집게 </td><td> 렌즈가 종 </td><td> T5130 </td><td> 뒤몽 생물학 # 5 </td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> BD </td><td> 300,928 </td><td> 2ml, Discardit II, 2pieces </td></tr><tr><td> 니들 </td><td> 브라운 Sterican </td><td> 4,665,120 </td><td> 1.2mm OD </td></tr></tbody></table>

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 drosophila antennal 엽

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

antennal 기억 상실증이 곤충 두뇌의 기본 후각 중심, 척추 후각 망울 1-5의 해부 학적 및 기능적 동등을 나타냅니다. 외부 세계에서 후각 정보는 그들이 표현하는 구체적인 후각 수용체에 따라 glomeruli라는 neuropil의 독특한 지역으로 분리 후각 감각 뉴런 (OSNs)에 의해 antennal 엽 전달된다. 여기, 누구의 프로세스 모두 현지 interneurons있는 OSN axons 시냅스 (LNs)는 높은 후각 뇌 영역 후각 정보를 전달하는 다양한 glomeruli 및 프로젝션 뉴런 (PNs)를 신경을 분포시키다하실 수 있습니다. antennal 엽의 OSNs, LNs 및 PNs의 활동의 광학 이미징 - 전통적으로 합성 칼슘 지표 (예 : 칼슘 녹색, FURA-2) 또는 전압에 민감한 염료 (예 : RH414)를 사용 - 긴 이해하는 중요한 테크닉에게 얼마나 후각 자극은 공간과 시간적 패턴으로 표현됩니다곤충 6-10 여러 종류의 사구체 활동. 이러한 형광 칼슘 지표 G-CAMP 11,12 및 Cameleon 13, 발광 생물 칼슘 표시기 GFP-aequorin 14,15, 또는 시냅스 전송 리포터 유전자로 인코딩된 신경 활동 기자의 개발, synapto-pHluorin 16을 이루었습니다 fruitfly의 후각 시스템 neurophysiological 이미징 특히 접근 Drosophila melanogaster는 자사의 종합적-설명한 분자 electrophysiological 및 neuroanatomical 속성 2,4,17을 보완. 이 기자는 선택적으로 악취-evoked 얼마나 높은 공간과 시간적 해상도로 해부하는 후각 회로 내의 뉴런의 정의 인구의 이진 transcriptional 제어 시스템 (예 : GAL4/UAS 18 LexA / LexAop 19,20, Q 시스템 21)를 통해 표현할 수 신경 활동은 대표 변조 및 22-24로 변화하고 있습니다 &lt;/&gt;이 저녁을 먹다. 여기에서 우리는 G-CAMP 25-27을 사용 Drosophila antennal 엽에서 냄새 evoked 응답을 측정하기 위하여 준비 및 분석 방법을 설명합니다. 동물의 준비는 최소한 침략적이며 넓은 필드 형광 공촛점과 두 광자 현미경을 사용하여 이미지에 적용할 수 있습니다.

우리는 생활 antennal 엽에서 냄새 evoked 칼슘 반응을 측정하고 분석하기 위해 설립 기법을 설명<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

촉각엽(antennal lobe)은 곤충 뇌의 일차 후각 중심지로, 척추동물의 후각...의 해부학적 및 기능적 상동 기관에 해당합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 세포 내 칼슘 변화의 광학 이미징을 통해 초파리의 후각 뉴런과 안테나 엽(antenna lobe)의 생리학적 활성을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마운팅 블록 와이어 홀더와 안테나 쉴드를 조립합니다. 그다음, 형광 칼슘 센서인 GCaMP를 발현하는 초파리를 블록에 장착하고 고정합니다.초파리를 고정한 후, 초파리 머리 윗부분의 큐티클을 절개하여 안테나 로브(antenna lobes)를 노출시킵니다. 절차의 마지막 단계는 초파리를 현미경 아래에 두고 냄새로 자극을 주는 것입니다. 최종적으로 칼슘 센서인 G camp의 상대적 형광 변화 기록을 통해 DLA 안테나 로브에서 냄새로 유발된 활동 패턴을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 냄새가 후각 회로의 서로 다른 수준에서 신경 활동의 공간적 및 시간적 패턴으로 어떻게 표현되는지 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 전기생리학과 같은 다른 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 기록 전극으로는 접근할 수 없는 유전적으로 식별된 뉴런의 활동을 기록할 수 있다는 점입니다. 이러한 방법을 통해 냄새의 신경 처리 과정에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.또한 청각 및 후각 계통과 같이 joof 뇌의 다른 영역에도 적용할 수 있습니다. 먼저, 나사가 전면 너머로 돌출되지 않도록 플렉시글라스 마운팅 블록의 뒷면으로 나사를 끼웁니다. 정밀 드릴을 사용하여 블록의 표면 아래를 파내어 두께를 줄임으로써, 파리를 위한 원형 챔버의 상단 경계에 홈을 만듭니다.해부 현미경 하에서, 초파리를 고정하기 위한 칼라를 만들기 위해 메스로 구리 그리드를 슬릿 바닥과 수직이 되도록 바닥에 가깝게 절단합니다. 초파리를 삽입하기 용이하도록 생성된 두 플랩의 높이가 수평인지 확인하십시오. 이쑤시개를 사용하여 원형 챔버 위쪽의 마운팅 블록에 순간접착제를 소량 도포합니다.파리 표본의 경우, 구리 그리드를 접착제 위에 올리고 슬릿이 블록의 중앙에 오도록 위치시킵니다. 그리드를 부드럽게 누른 후, 핀셋을 사용하여 과도하게 도포된 접착제를 제거합니다. 양쪽 플랩 아래에 접착제를 소량씩 추가하고, 슬릿이 똑바로 아래를 향하도록 그리드를 블록 앞쪽으로 접습니다.그리드의 상단이 블록과 수평이 되도록 맞춘 후 완전히 건조시킵니다. 와이어 홀더를 만들려면 플라스틱 커버슬립을 절반으로 자르고 중앙 부분을 제거하여 U자 모양으로 만듭니다. 밀랍을 사용하여 U자 상단에 와이어 조각을 고정하되, 와이어가 너무 팽팽하지 않게 합니다.종이 펀치를 사용하여 플라스틱 커버슬립에 구멍을 뚫어 안테나 쉴드를 제작합니다. 커버슬립의 가장자리를 0.5 by 0.7 centimeters 크기로 다듬습니다. 구멍이 뚫린 플라스틱 커버슬립을 점착테이프 위에 붙인 다음, 구멍을 통해 노출된 테이프 위에 에탄올 한 방울을 떨어뜨립니다.접착제를 제거하려면 적절한 유전자형을 가진 1~3주령의 파리를 얼음 위에 올려 냉각시켜 마취시킵니다. 해부 현미경 하에서 파리의 날개 관절 부위를 잡아 구리 그리드를 따라 등면부터 밀어 넣어 목 부분이 걸려 매달리게 합니다. 필요한 경우, 파리가 아래를 향하도록 회전시킵니다.파리가 탈출하지 못하도록 파리의 머리 앞에 가는 선인장 가시를 배치하고, 구강관(proboscis)이 움직이지 않도록 그 앞에 가시를 위치시킵니다. 머리 윗부분이 블록의 윗면과 수평이 되도록 확인하며 밀랍을 사용하여 선인장 가시를 블록에 고정합니다. 에탄올에 녹인 로진(rosin) 한 방울을 사용하여 파리의 머리를 블록에 고정합니다.블록을 가습 상자에 넣고 로진이 약 1시간 동안 굳도록 둡니다. 핀셋을 사용하여 안테나 플레이트를 앞으로 당기고, 안테나와 머리 사이의 큐티클 접힘 부위에 와이어 홀더를 넣습니다. 밀랍을 더 사용하여 홀더를 블록 전면에 고정합니다.블록에 내장된 나사를 사용하여 와이어 홀더를 조심스럽게 앞으로 밀어 안테나 플레이트와 머리 사이에 공간을 만듭니다. 안테나 쉴드를 초파리 머리 윗부분에 중앙이 맞도록 위치시킵니다. 밀랍을 사용하여 쉴드를 마운팅 블록 상단에 고정합니다.블레이드 스플리터를 사용하여 쉴드의 테이프에 작은 구멍을 내어, 촉각 뒤쪽의 초파리 머리 큐티클을 노출시킵니다. 이때 시료가 새어 나가는 것을 방지하기 위해 구멍이 눈 너머까지 확장되지 않도록 해야 합니다. 테이프와 큐티클 사이의 구멍을 2액형 실리콘으로 밀봉합니다.초파리 머리 윗부분의 과도한 실리콘을 제거합니다. 초파리 머리에 drosophila ringer saline 한 방울을 떨어뜨리되, 누수가 없으며 촉각은 완전히 건조한 상태를 유지하도록 합니다. 사파이어 칼날을 사용하여 촉각 바로 뒤의 큐티클 주름을 따라 가볍게 절개합니다.그 다음 눈을 따라 자르고 뒤쪽의 안장(selli)을 가로질러 자릅니다. 마지막으로 큐티클 조각을 절개선 너머로 접은 뒤 아래쪽에서 자릅니다. 안테나 신경이 끊어지는 것을 방지하기 위해, 미세 핀셋을 사용하여 샘과 기관을 조심스럽게 제거합니다.Drosophila 링거 용액으로 반복해서 세척한 후, 머리 부분에 큰 방울 하나를 남겨둡니다. 깨끗한 핀셋을 사용하여 2 mL 플라스틱 주사기에 셀룰로오스 패드를 삽입합니다. 필터 팁 피펫을 사용하여 희석된 취기물 20 µL를 도포합니다.이미징에 필요할 때까지 주사기를 막고 캡을 씌워 둡니다. 초파리가 고정된 마운팅 장치를 현미경 아래에 놓습니다. 대물렌즈를 내려 초파리 머리 위의 링거 용액(ringer solution)에 닿게 합니다.명시야 조명 하에서 뷰파인더를 통해 관찰하며, 머리 캡슐의 구멍이 중앙에 오고 그 경계가 초점에 맞도록 표본을 배치합니다. 형광 조명으로 전환하고 GCaMP의 기저 녹색 형광으로 뚜렷하게 나타나는 표지된 뉴런이 보일 때까지 초점을 조정합니다. 현미경에 장착된 CCD 카메라와 적절한 획득 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득하고, 관심 있는 사구체의 초점을 맞춥니다.이미징 영역으로의 여기광을 제한하기 위해 조명 광경로의 조리개를 반드시 닫으십시오. 후각계의 출구 부분을 초파리 안테나 앞 약 0.5 centimeters 지점에 위치시킵니다. 여기에서는 여러 사구체에서 발현을 유도하는 후각 감각 뉴런 프로모터의 제어 하에 GCaMP 1.6을 발현하는 초파리의 항문엽이 나타나 있습니다. 1% propionic acid 자극은 DC four 및 DP one L 사구체에 분포하는 후각 감각 뉴런의 세포 내 칼슘 증가를 나타내는 GAMP 형광 증가를 유발합니다. propionic acid에 대한 사구체 DC four 및 DP one L의 칼슘 반응의 시간적 역동성이 여기에 표시되어 있습니다.검은색 선은 8마리 동물에 걸쳐 관심 영역 내 평균 delta F over F의 중앙값을 나타내며, 회색 영역은 분포의 제1사분위수와 제3사분위수 사이의 범위를 나타냅니다. 하단의 히트맵은 개별 동물의 반응을 보여줍니다. 녹색으로 표시된 마젠타색 상자는 GCaMP의 기선 형광 수준 대비 사구체의 피크 반응을 계산하기 위해 평균을 낸 프레임을 나타내며, 여기서 정량화되어 표시됩니다.형광 리포터의 광퇴색(bleaching)을 보정하는 것은 반응 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 왼쪽 패널의 피크 샘플 데이터는 반응의 형태에 큰 변화 없이 보정할 수 있습니다. 오른쪽 패널의 샘플 데이터는 보정 후 심각한 영향을 받았는데, 이는 냄새 자극 종료 후 신호가 감소하여 기저선(baseline) 아래로 유지되었기 때문일 가능성이 높습니다. 이 기술을 숙달하면 약 30분 정도에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행하는 동안 안테나를 완전히 건조한 상태로 유지하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 냄새를 감지할 수 없습니다. 이 영상을 시청하고 나면 이미지 준비 방법과 냄새 분석 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.초파리의 신경 활동을 유도합니다.

calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

꿀벌은 appetitive 후각 학습 패러다임 (당 시설)에서 시설 수 있습니다. 자극과 같은 냄새를 사용하여, 우리는 동시에 칼슘 이미징이 버섯 신체 뉴런에서 냄새 evoked 활동을 측정하는 데 사용하는 동안 기록되는 행동 방식을...

생체내 칼슘 2 + - 허니 비에 강한 학습하는 동안 버섯 바디 뉴런의 영상

이 비디오는 GCaMP를 사용하여 초파리 뉴런의 생체 내 칼슘 이미징을 설명합니다. 주요 프로토콜 클립은 후각 조절 실험 중 버섯체 뉴런에서 GCaMP 형광의 변화를 기록하는 방법을 보여줍니다.

초파리 In Vivo 칼슘 이미징: 뉴런 활동의 기능적 이미징 방법

이 비디오는 리간드 결합 및 형광 이미징을 사용하여 초파리에서 감각 뉴런 반응을 감지하는 방법을 보여줍니다. 리간드는 뉴런 수용체에 결합하여 칼슘 유입을 일으킵니다. 칼슘은 지표 복합체에 결합하여 형광 방출을 유발하여 리간드에 대한 신경 반응을 확인합니다.

Drosophila의 감각 뉴런에서 생리적 반응 감지

이 비디오는 파리에서 시냅스적으로 국소화된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징 방법을 보여줍니다. 현미경 검사를 위해 파리를 준비하고, 후각 조절을 수행하고, 냄새로 인한 칼슘 유입을 시각화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

생체 내 Drosophila melanogaster에서 Synaptically Localized Calcium Sensors를 사용한 칼슘 이미징

출처: Ishimoto, H. et. al., 초파리의 내분비 신호에 대한 뇌 반응을 시각화하기 위한 생체 외 칼슘 이미징. J. vis. Exp. (2018) 이 비디오는 연구를 위한 칼슘 이미징을 보여줍니다.초파리 뉴로펩티드에 대한 뇌 반응. 형광 칼슘 지표를 발현하는 뉴런은 세포 내 칼슘 역학과 신호 분자에 대한 기능적 반응을 나타냅니다.

뉴로펩티드에 대한 초파리 뇌 반응을 연구하기 위한 Ex vivo 칼슘 이미징

초파리의 앞다리와 주둥이는 미각 감각 뉴런의 풍부한 레퍼토리를 포함하고 있습니다. 여기에서는 칼슘 이미징을 사용하여 미각 페로몬의 외인성 적용 시 살아있는 파리의 앞다리와 주둥이에 있는 감각 뉴런의 생리적 반응을 측정하는 방법을 제시합니다.

의 생리적 반응을 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 감각 뉴런

이 문서에서는 초파리 계란 활성화 중에 2 + 칼슘을 시각화에 대한 적응력 생체 프로토콜을 설명합니다.

에서 이미징 칼슘<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 활성화에

여기에서 우리는 Drosophila 학습 및 기억의 맥락에서 pre-및/또는 후성 칼슘이 구상될 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 합성 국소화 된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징은 이러한 유형의 연관 학습의 기초가되는 시냅스 가소성이 결정될 수 있도록 고전적인 후각 조절 패러다임과 결합됩니다.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

칼슘 이미징 접근법은 용액이 라벨에 적용되는 동안 깨어 있는 파리의 뇌에서 미각 유도 반응을 기록할 수 있습니다. Drosophila melanogaster 의 1차 미각 반응이 예로 사용되지만 이 프로토콜은 다운스트림 뉴런 또는 다른 종을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

생체 내 성체 초파리에서 미각 유도 신경 반응의 칼슘 이미징

학습 및 기억과 같은 인지 과정 중 세포 활동을 연구하는 데 있어 중요한 장벽은 생체 내 이미징 준비를 위해 마취제를 사용하는 것입니다. 마취는 초파리(Drosophila)를 포함한 여러 모델에서 단기 기억과 인지를 손상시킵니다.이 연구는 마취 없이 생체 내 이미징을 위해 성인 초파리를 준비하는 독특한 방법을 제시합니다.

생체 내 마취되지 않은 초파리 성충의 신경 활동 이미징

우리는 고정을 위해 국소 조직 접착제를 사용하여 초파리 유충 후각 뉴런에 대한 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 안정성을 향상시켜 신뢰할 수 있는 생체 내 및 생체 외 실험을 용이하게 합니다. 맞춤형 R 스크립트는 칼슘 신호를 분석하여 상세한 신경생리학적 연구를 위한 효율적인 플랫폼을 제공합니다.

3령 초파리 멜라노가스터 유충에서 후각 회로 뉴런의 생체 내 및 생체 외 칼슘 이미징

학습하세요 Drosophila melanogaster의 안테날 엽에서 냄새 유발 칼슘 반응을 광학 이미징으로 측정하는 방법을. 이 기술은 후각 신경의 시공간 활동 패턴을 시각화하여 신경 과학 연구에 활용됩니다.

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

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