Name: 심장 기능 면역 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 심장 면역 세포 분리법으로 콜라게나제 소화 없이 기능성 세포를 확보하는 방법입니다. HBSS 주입 및 흡입을 통해 활성화되지 않은 면역 세포를 분리하여 심장 면역학 연구의 신뢰성을 높입니다.

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이 작품은 UNCF - 머크 대학원 과학 연구 논문 장학생 (JLM), 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소 부여 RO1 - HL - 62228 (JSJ)와 RO1 - HL - 073990 (JSJ)에 의해 지원되었다.

1. 행크스 '잔액 소금 솔루션의 준비 (HBSS) <ol><li> 압력솥 1 L의 유리 비커는 1000 ML은 실린더 졸업하고, 바 저어. </li><li> 두 번 증류수로 900 ML 표시에 autoclaved 1 L의 유리 비커에 HBSS 분말 솔루션 Reconstitute. </li><li> Hepes 나 + 소금 3.4 g와 HBSS 용액을 혼합하고 집중 HCL 또는 NaOH을 사용 7.35-7.41 사이의 값을 산도를 조정합니다. </li><li> 원하는 산도가 획득하고 안정적​​인 유지되면 알부민이 완전히 해소되기 전까지 실온에서 솔루션에 알부민 소 혈청 5g을 추가합니다. </li><li> 전체 볼륨 1000 ML 표시에까지 솔루션, antimyotic, 항생제를 두 번 증류수 10 ML을 추가합니다. </li><li> 철저하게 솔루션을 저어. </li><li> HBSS 용액을 필터하고 나중에 사용하기 위해 50 ML 팔콘 튜브에 그것을 구분합니다. 추가 튜브는 냉동과 나중에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2. 동물 PreparatioN - Tracheal 튜브의 삽입 <ol><li> 필요한 악기 및 tracheal 튜브 (즉, 포셉, 가위, tracheal 튜브 3-0 블랙 꼰의 봉합, 작은 동물 환풍기 등) 삽입에 대한 자료와 트레이를 준비합니다. </li><li> 쥐 1 xylazine 2 케타민을의 비율에 케타민을 / xylazine 칵테일과 함께 완전히 anesthetized되면​​, 쥐의 복부, 가슴, 그리고 목구멍을 면도. 깊은 마취 상태가 달성되었는지 확인하려면, 쥐의 발가락을 꼬집어 및 사지의 페달 철회 있는지 확인하십시오. 쥐의 모든 incisions하기 전에 깊은 anesthetized 있는지 확인하십시오. </li><li> 30 ° 각도로 경사하는 도마에 제기 머리와 쥐 장소 </li><li> 중반 복부에서 아래턱 아래로 피부 절개를합니다. 기관을 노출하기 위해 목 앞쪽에 삼각형의 근육을 멀리 해부하다. </li><li> 기관에 따라 3-0 검은 꼰 치료를 놓습니다. </li><li> 연골 고리 사이의 기관에 절개를합니다D tracheal 튜브를 삽입합니다. 기관에 tracheal 튜브를 확보하기 위해 단단히 봉합을 묶어. </li><li> 작은 동물의 호흡에 tracheal 튜브를 연결합니다. </li></ol> 3. 면역 세포의 격리를위한 악기 준비 <ol><li> 면역 세포 격리 절차에 대한 인 스트 루먼트 (즉, 포셉, 가위, HBSS, 바늘 빠른 선배를 통해 소프트 테플론 24 게이지 박스터 intravascular을 다듬은 사람)와 트레이를 준비 </li><li> 이 10cc 주사기를 준비, HBSS가 들어있는 세포를 aspirating위한 pericardial SAC 및 보유, 다른 하나에 버퍼를 소개하는 HBSS 한 주사기를 입력하십시오. 3.2.1. 격리 절차 원래 길이의 1 / 2 4분의 3으로 바늘 빠른 선배 (1.6 ㎝) 이상 24 게이지 박스터 intravascular의 테플론 팁을 줄이십시오. </li><li> 모든 주사기, 버퍼, 그리고 빈 15 ML 팔콘 튜브 (절차가 완료되면 압축을 푼 유체를 잡아) 얼음에 놓으십시오. </li></ol> &lt;P 클래스 = "jove_title"&gt; 4. 면역 세포 격리 <ol><li> 당신은 칼 모양의 프로세스를 도달할 때까지 복부 벽 (linea 알바 따라)에 중간선 절개를합니다. </li><li> 약간 옆으로 칼 모양의 프로세스 시작, 겨드랑이쪽으로 각도로 계속 갈빗대를 통해 양국 incisions합니다. 폐, 심장, 또는 심낭을 구멍하지 않도록주의하십시오. </li><li> 흉골 양쪽에 incisions가 완료되면, 중간에 가로 절단, 낮은 갈비에서 다이어프램 멀리 해부하다. 참고 : 심낭의 다이어프램과 손상을 방지하려면 흉골에 연결하여 어디까지 인식한다. 심낭은 횡경막의 반대편에 연결되어있는 곳을 참고하는 랜드마크로 낫 모양의의 인대를 사용합니다. 심낭을 절단하는 경우 또한, 세포를 분리하는 기능이 손실됩니다. </li><li> 부드럽게 흉강과 마음을 (여전히 심낭에 의해 캡슐) 노출 ribcage 한쪽 리프트.</li><li> HBSS 채워진 주사기를 가지고 흉골과 심장 (선호 더 주동이의 꼬리 이상) 사이의 약 절반 방법 pericardial SAC의 지점을 찾아의 테플론 팁을 삽입 심낭의 두 층을 통해 신속 - 캐서린 단축. </li><li> 카테 테르가 자리에되면, HBBS 버퍼 2 ~ 3 ML과 pericardial 공간을 채우기 부드럽게 진행합니다. 당신은 pericardial 공간이 확장 통보시 카테 테르가 올바르게 위치하면 즉시 알 수 있습니다. 더 충전이 목격되지 않으면 철회하고 빠른 선배를 재조 정할. </li><li> pericardial SAC가 채워진 경우, 다른 10 CC에 주사기를 가지고 심낭에 다시 팁을 장소와 버퍼를 aspirating 시작합니다. 동일한 항목 구멍 사용할 수 있습니다 또는 다른가 만들 수 있습니다. 특히 심장의 아래쪽에 흡입을 제공하면서 끝이 pericardial SAC의 벽에 너무 가까이 오지 않는 있는지 확인하십시오. 이것은 세포가 포함된 세포의 pericardial SAC와 손실을 펑쳐링으로 이어질 수S. </li><li> 버퍼 aspirating 동안 카테 테르 팁은 가능한 한 많은 버퍼를 수집하기 위해 pericardial SAC 내부 주위를 이동할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 이렇게 여러분이 약간 심장막 찢어하고 원래 구멍보다 큰 가슴의 상단에있는 구멍을 만들어 않아도 당황하지 마십시오. 한 심장막 아직 충분히 마음을 주변으로 당신은 여전히​​ 버퍼의 낮은 양의 불구하고 가슴에 또 다른 씻고을 수행할 수 있습니다. 세포의 최적의 금액 수집, 3-4 추가적인 세척이 필요합니다. <ol start="9"><li> 얼음에 놓여 있던 팔콘 튜브로 추출 버퍼를 놓습니다. </li><li> 심장이나 폐, 및 / 또는 추가 연구를 위해 필요한 경우 다른 조직을 제거합니다. 면역 세포 및 기타 조직의 수집 후, 쥐 신속하게 그리고 편안하게 euthanized해야합니다. </li><li> 4 200g에서 10 분 ° C.에 대한 수집 면역 세포 샘플을 원심 분리기 항상 얼음에 튜브를 유지사용하지 않을 때 인치 </li><li> Hyclone 버퍼 또는 HBSS 1 ML에 뜨는와 reconstitute 펠렛을 제거합니다. </li></ol> 참고 : 면역 세포 격리 절차 후 각 마음에서 얻은 면역 세포의 수를 계산하는 것이 중요합니다. 5. 대표 결과 : toluidine 파란색과 safranin O / alcian 파란이 기술과 스테인드로 얻은 고립 심장 마스트 세포의 예제는 각각 2A 및 2B 수치로 표시됩니다. 그림 3, 심장 마스트에서 볼 수 있듯이, 같은 화합물 80분의 48과 모건 외에서 설명한대로 물질 P로 알려진 activators와 치료 후 히스타민을 풀어 자신의 능력을 유지. CD4의 유동세포계측법에서 9 대표 분산형 플롯 + 세포와 CD8 + 세포는 각각 그림 4와 5에 제공됩니다. T - lymphocytes는 더욱 식별이 기술에서 세포 인구로 phenotyped 있습니다. 심장 면역 세포 격리 절차의 그림 1. 플로우 차트. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig2.jpg"> . 심장 마스트 세포의 그림 2 Histological 대표 이미지는 다음과 같이 스테인드 있습니다 : (A) toluidine 청색과 함께 (B) safranin O / alcian 파란색입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig3.jpg"> 그림 3. epicardial 심근 지역에서 분리된 화합물 80분의 48 (10μg/mL)와 물질 P (10μM)로 자극을 심장 마스트 세포의 기능 연구. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig4.jpg"> 그림 4. 격리 CD4 + 세포 물질 P (1:100 dilut으로 표시 대표 유동세포계측법의 분산형 플롯이온). <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig5.jpg"> 그림 5. 물질 P (1:100 희석)로 표시 격리 CD8 + 세포의 대표 유동세포계측법.

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<li>Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+isolating+functional+mast+cells+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">A novel technique for isolating functional mast cells from the heart.</a> Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).</li>
</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

심장 면역 세포를 분리 이러한 방법은 일반적으로 전통적인 효소 소화 절연 기술 중에 발생하는 원치 않는 작동하지 않고 자신의 기능, 표현형, 그리고 성숙의 분석을 수 있습니다. 이 기술을 얻은 세포의 평균 총수는 쥐 심장 당 400,000 주위되며, 이러한 세포의 차동 얼룩 및 유동세포계측법 분석 T - lymphocytes의 혼합 인구 (~ 70 %), macrophages (~ 12 %)와 마스트 세포와를 나타냅니다 이 기법의 사용. (~ 12 %). 13, 따라서 14, 심장 면역 세포 인구의 자세한 분리 정제 방법이 필요합니다. 절연 면역 세포 기능 연구, 유동세포계측법, immunofluroescence 및 공동 문화 실험을 포함하여 여러 어플 리케이션에 사용할 수 있습니다. 더 정화 및 실험을 통해 이러한 고립된 전지 심장 리모델링의 과정에서 면역 체계의 역할을 이해하는 유용한 도구를 제공합니다. <p cl엉덩이 = &quot;jove_step&quot;&gt; 동물 안...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 및 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 행크스 &#39;균형 소금 </td><td> 시그마 </td><td> H4891 </td><td> 한 병은 행크스 &#39;대차 소금 1 패하게 솔루션. Reconstitute 행크스 &#39;밸런스 소금 절차의 일환으로 솔루션입니다. </td></tr><tr><td> 항생제 - Antimyotic </td><td> Gibco </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H3784 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> 250 ML의 Nalogene 필터 병 </td><td> Thermoscientific </td><td> 157-0020 </td><td></td></tr><tr><td> 12 N HCL </td><td> 피셔 과학 </td><td> CAS 7647-01-0 </td><td> 6 N 들어, deionized에 HCL의 동일한 볼륨을 추가물. </td></tr><tr><td> 10 N NaOH </td><td> 피셔 과학 </td><td> SC267 </td><td> 5 N 들어, 탈이온수에 NaOH 동등한 볼륨을 추가합니다. </td></tr><tr><td> 두 번 증류수 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 특정 장비의 테이블 : <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 및 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 3 - O 봉합사 실크 꼰 </td><td> Ethicon 제품 </td><td> SA64H </td><td></td></tr><tr><td> 작은 동물 환풍기 </td><td> CWE 법인 </td><td> SAR - 830 </td><td> 분 당 40.5 심호흡으로 호흡 속도를 설정합니다. </td></tr><tr><td> 베벨 18 게이지 바늘 </td><td> BD Biosciences </td><td> 305,199 </td><td> tracheal 튜브로 사용하기 위해 원래 길이의 1 / 2 4분의 3로 바늘을 낸다. </td></tr><tr><td> 24 게이지 박스터 빠른 선배 카테터의 테플론 팁 (바늘이 제거된) </td><td> 벡스터 </td><td> 2N111 </td><td> 1 / 2 4분의 3로 테플론 팁 길이를 줄입니다. </td></tr><tr><td> 10 CC 주사기 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-823 - 16B </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 팔콘 튜브 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352,097 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RT6000B 냉장 원심 분리기 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 75-004-377 </td><td> 사전 냉각 기억하고 4 유지 ° C. </td></tr><tr><td> Hyclone </td><td> Thermoscientific </td><td> S300030.02 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser 과학 </td><td> HS - LB - 1483 </td><td></td></tr></tbody></table>

심장 기능 면역 세포의 분리

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

심장 면역 세포들은 많은 심장 질환의 병리 리모델링에서 재생 역할에 대한 관심을 쫒아오고 있습니다 마스트 세포, T - 세포 및 macrophages 포함 1-5 이들 면역 세포;. 저장하고 크린 시토킨 및 포함하여 생물학적으로 활성 중재자 다양한 릴리스 같은 tryptase 같은 프로 테아제. 6-8이 중재자는 매트릭스 metalloproteinases를 활성화하거나 modulating 심장 섬유아 세포 &#39;기능에 의해 콜라겐 축적을 유발하여 세포외 기질 대사의 주요 선수로 표시되었습니다. 9-11하지만, 심장 면역 세포를 분리에 사용할 기술이있다 그들은 심근 조직을 소화 박테리아 collagenase을 사용하기 때문에 문제가되었습니다. 이 기술은 면역 세포의 활성화 및 따라서 기능의 손실을 초래합니다. 예를 들어, 심장 마스트 세포가 degranulation의 원인이 화합물에 훨씬 적은 반응이된다. 12 따라서, 우리는 t을 허용하는 기술을 개발그는 심장 질환에서 이러한 세포의 역할에 대한 이해로 이어질 것입니다 기능적 심장 면역 세포의 분리. 13, 14 이 방법은 심장의 해부 쥐의 검상 돌기 프로세스, 겨드랑이와 낫 모양의 제품 인대의 위치, 그리고 심낭과 친숙이 필요합니다. 이러한 랜드마크 프로 시저의 성공을 증가하고 심장 면역 세포의 높은 수율을 보장하기 위해 중요합니다. 이러한 격리 심장 면역 세포는 그 기능 표현형, 만기, 그리고 다른 심장 세포와 공동 배양 실험들은 상호 작용의 더 나은 이해를 얻을 수의 특성에 사용될 수 있습니다.

마음에서 기능적 면역 세포를 분리를위한이 방법은 이러한 세포의 감소 반응의 결과로, 원치 않는 면역 세포 활성화의 원인이 collagenase의 소화의 종래의 방법에 대한 대안을 제공합니다. 격리 우리의 방법은 효소 소화와 관련된 문제를 피함으로써 기능 심장병 면역 세포를 산출.

심장 면역 세포는 여러 심장 질환의 병리적 리모델링에서 수행하는 역할로 인해 관심을 받고 있습니다.1-5 이러한 면역 세포는...

본 절차의 전반적인 목적은 기능적인 심장 면역 세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 쥐에게 인공호흡을 실시하고 심장을 둘러싸고 있는 심낭을 노출함으로써 수행됩니다. 그다음, 헨크 평형염 용액(Hank's balance salt solution) 또는 HBSS를 심낭강 내로 주입합니다.그런 다음 심낭 공간의 면역 세포가 포함된 HBSS를 흡입하여 제거합니다. 마지막으로, 분리 절차를 통해 얻은 면역 세포의 수를 계산합니다. 최종적으로, 심장 면역 세포의 기능성과 생물학적 활성을 평가하기 위해 화학적 탈과립 또는 공배양 실험, 유세포 분석, 면역형광 분석 또는 세포의 약리학적 처리를 수행할 수 있습니다.본 실험실의 세 연구원이 이 절차를 시연할 것입니다. 대학원생인 Jennifer McLarty, 박사후 연구원인 Giselle Melendez, 그리고 수석 기술자인 Spencer입니다. 콜라겐 소화법과 같은 기존의 면역 세포 분리 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 원치 않는 면역 세포 활성화 및 손상을 방지하며, 실험적 처리에 대한 면역 세포의 반응성을 보존한다는 것입니다. 시작하기 전에, 커팅 보드를 30도 각도로 기울이십시오.그 다음 Dremmel 전동 공구를 사용하여 18 gauge 베벨 바늘 끝부분의 1/2에서 3/4 정도를 잘라냅니다. 이는 쥐의 모니터링이 끝난 후 기관내 삽관을 하기 위해 팁을 짧게 만드는 과정입니다. 적절한 마취 상태를 확인하기 위해 동물의 복부, 흉부 및 목 부위를 제모한 후, 복부 중앙부터 턱 아래까지 피부를 절개합니다.다음으로, 목의 전삼각근 부위의 근육을 절개하여 기관을 노출시키고, 기관이 노출되면 그 아래에 3-0 검은색 편조 봉합사를 배치합니다. 이제 연골 고리 사이의 기관을 절개하고 기관 튜브를 삽입합니다. 기관 튜브를 고정하기 위해 기관 주변의 3-0 봉합사를 단단히 묶어줍니다.다음으로, 기관내 튜브를 소동물 인공호흡기에 연결하고 호흡을 유도합니다. 심장과 폐에 충분한 산소 공급이 이루어지는지 확인하기 위해, 인공호흡기의 흡기와 호기 시 쥐의 흉부가 각각 균일하게 상승하고 하강하는지 확인하십시오. 면역 세포 분리를 시작하기 전에 10 cc 주사기에 HBSS를 채웁니다.그런 다음, 분리 절차를 위해 팁 길이를 짧게 만들 수 있도록 24 gauge Baxter 혈관 내 바늘 위 퀵 카테터의 부드러운 테플론 팁 끝부분을 1/2에서 3/4 정도 잘라냅니다. 24 gaug

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

야생형 마우스와 돌연변이 마우스의 개별 심근세포는 수축성과 칼슘 과도 상태를 연구하기 위해 심장에서 분리할 수 있습니다. 이를 통해 모든 원인에서 심장 기능 장애에 대한 세포 기능 장애의 기여도를 특성화할 수 있습니다.

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

인간의 심장 조직 심근 재생에 적합 할 수있는 다 능성 혈관 주위 전구체 세포 집단을 항구. 주연 세포와 CD34 + CD146 - - 외막 세포, 인간 심근에서 여기에 설명 된 기술은 원시 혈관, 즉 CD34 + CD146와 연관된 두 능성 간질 세포 집단의 동시 분리 및 정제를 허용한다.

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

이 프로토콜 격리, 식별 하 고 안정 된 상태 또는 염증 동안 쥐의 심근에 있는 면역 세포를 계량 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 제공 합니다. 프로토콜은 cytometry에 의해 더 분석 될 수 있는 단일 세포 현 탁 액의 세대에 대 한 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다.

절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별

이 글의 전반적인 목표, 특성화, 고립과 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포 (CSCs)의 분화에 대 한 프로토콜을 표준화 하입니다. 여기, 우리가 murine CSCs 분리 밀도 그라데이션 원심 분리 방법 및 CSC, 확산, 문화와 cardiomyocytes로 차별화에 대 한 정교한 방법을 설명 합니다.

절연, 특성, 및 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 분화

우리는 그들의 생물학 과 치료 잠재력의 기본적인 연구 그리고 조사를 위한 뮤린 심장 pericytes를 격리하고 정화하는 프로토콜을 설치했습니다.

뮤린 심장 pericytes의 격리 및 정화

여기서 제시된 프로토콜은 효소 소화를 통해 단일 세포 현탁액을 준비시킴으로써 인간 및 마우스 심근으로부터 대식세포 및 기타 비면역 세포의 다양한 서브세트를 분리하는 프로토콜이다. 유세포분석 기반 식별 및 절연 대식세포의 특성화를 위한 게이팅 방식도 제시된다.

인간과 마우스 심근 표본에서 대식세포 하위 세트 및 기질 세포의 분리

이 연구의 목표는 성인 심장에서 심근세포를 재현하고 DNA 함량 및 핵형성을 측정하는 방법을 개발하는 것입니다.

면역 세포 화학 및 Ploidy 분석을 위한 고정된 심혼에서 심근세포의 격리

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

여기에 제시된 프로토콜은 마우스 심장의 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN) 영역으로부터 심장 상주 대 식세포를 분리하기위한 단계별 접근법을 제공한다.

쥐 동방과 방실 결절에서 상주 심장 대 식세포의 분리 및 배양

여기서 우리는 유세포 분석을 사용하여 혈관 내 또는 내피 공간에서의 위치를 기반으로 심근 B- 림프구의 정량화 및 분화를위한 프로토콜을보고합니다.

유세포분석 기반 심근 B 세포의 정량화 및 분석

배우세요 심장 면역 세포 분리법으로 콜라게나제 소화 없이 기능성 세포를 확보하는 방법입니다. HBSS 주입 및 흡입을 통해 활성화되지 않은 면역 세포를 분리하여 심장 면역학 연구의 신뢰성을 높입니다.

심장 기능 면역 세포의 분리

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