JoVE 실험 백과사전
생물학적 기술
0 조회수 • 4:04 분 • July 8th, 2025
적절한 배양 배지에서 단층 상피 세포로 시작합니다. 이 세포는 막을 가로지르는 표면 수용체인 인테그린을 발현합니다. 배양 배지에는 당단백질인 상피 세포 분비 피브로넥틴이 포함되어 있습니다.
그람 양성 병원성 박테리아인 황색포도상구균 현탁액을 배양판에 첨가합니다. 이 박테리아는 세포벽에 고정된 피브로넥틴 결합 단백질(FnBP)을 포함합니다.
플레이트를 배양하여 박테리아 감염을 시작하며, 여기서 피브로넥틴은 박테리아의 FnBP 및 상피 숙주 세포의 인테그린에 결합합니다. 이 삼자 FnBP-피브로넥틴-인테그린 상호작용은 숙주에서 박테리아 내재화를 매개합니다.
엔도펩티다제 효소인 리소스타핀으로 세포를 처리하고 배양합니다. 리소스타핀은 세포외 박테리아의 세포벽에 선택적으로 들어갑니다. 펩티도글리칸의 펜타글리신 가교를 절단하여 세포내 박테리아가 리소스타핀으로부터 보호되는 동안 펩티도글리칸을 용해합니다.
배양액에 단백질 분해 효소를 보충하여 나머지 리소스타핀을 비활성화하여 단계에서 세포 내 박테리아를 죽이는 것을 방지합니다.
배양액에 용해 완충액을 추가하면 숙주 상피 세포가 파열되고 세포 용해물에서 세포내 박테리아가 방출됩니다. 그 후, 박테리아를 함유한 세포 용해물을 적절한 배양 플레이트에 도금하고 배양합니다.
박테리아는 성장하고 증식하여 박테리아 콜로니를 형성하며, 이를 분석하여 숙주 세포의 박테리아 내재화 정도를 추정할 수 있습니다.
세포 접종 전에 저배율 현미경으로 24웰 플레이트의 모든 웰을 관찰하여 세포가 건강하고 예상대로 성장하는지 확인하십시오. 그런 다음 24웰 플레이트에서 사용한 세포 배양 배지를 제거하여 폐기하고 100% 합류 세포를 포함하는 각 웰에 500마이크로리터의 박테리아 현탁액을 첨가합니다. 세포를 섭씨 36도 및 이산화탄소 5%에서 2시간 동안 배양합니다.
개선된 효소 보호 분석법으로 세포내 박테리아를 정량화하려면 텍스트 원고에 언급된 대로 4X 용해 완충액, 2% Triton X-100, 트립신-EDTA 및 리소스타핀 스톡 및 작업 용액을 준비합니다.
다음으로, 리소스타핀 작업 용액 250마이크로리터에 6밀리리터의 완전 감염 배지를 첨가하여 리소스타핀이 보충된 6.25밀리리터의 완전 감염 배지를 준비합니다. 그런 다음 리소스타핀이 보충된 완전 감염 배지 250마이크로리터를 각 웰에 넣고 손으로 플레이트를 돌려 플레이트를 부드럽게 교반합니다.
리소스타핀이 세포외 박테리아를 죽이도록 하려면 섭씨 36도와 이산화탄소 5%에서 세포를 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 밀리리터당 20마이크로그램의 프로테이나제 K 10마이크로리터를 첨가하고 실온에서 2분 동안 세포를 배양하여 리소스타핀을 비활성화합니다.
다음으로, 250마이크로리터의 4X 용해 완충액을 첨가하여 삼투압 충격에 의해 세포를 용해시키고 세포를 섭씨 36도에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 세포 용해물을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 세포가 완전히 용해되고 균질화되도록 합니다.
그런 다음 자동 나선형 플래터를 사용하여 각 웰의 황색포도상구균 부하를 결정하고 한천 플레이트를 섭씨 36도에서 18-24시간 동안 배양합니다. 다음날 콜로니 카운터로 콜로니 수를 세어 각 웰의 세포내 황색포도상구균 부하를 계산합니다.