JoVE 실험 백과사전
생물학적 기술
0 조회수 • 5:39 분 • July 8th, 2025
알레르겐(비병원성 항원)에 노출되면 항원 제시 세포는 알레르겐을 처리하여 제2형 도우미 T-림프구에 제시합니다. 이 T-림프구는 B-림프구를 유발하여 형질 세포로 분화하고 순환 호염기구(과립 함유 분비 세포) 표면의 고친화성 IgE 특이적 Fc 수용체에 결합하는 면역글로불린 E, IgE, 항체를 생성합니다.
이후 알레르겐에 노출되면 IgE-Fc 복합체는 알레르겐을 인식하고 가교하여 호염기구를 활성화하여 사이토카인 및 β-헥소사미니다아제를 포함한 리소좀 효소와 같은 매개체로 구성된 과립을 방출하여 강력한 염증 반응을 유발합니다.
시험관 내에서 테스트 항원의 알레르기 가능성을 스크리닝하려면 인간 IgE 특이적 Fc 수용체를 발현하는 형질도입된 쥐 암성 호염기구의 현탁액으로 시작합니다. 알레르기 기증자의 IgE 함유 인간 혈청으로 치료하십시오. IgE 항체는 호염기구 Fc 수용체에 결합하여 감작합니다.
다음으로, 감작된 호염기구에 완충액과 적절한 양의 시험 항원을 추가합니다. 항원은 Fc-수용체에 결합된 IgE에 대한 친화력에 따라 항체와 가교하고 호염기구 탈과립화를 시작하여 β-헥소사미니다제를 포함한 매개체를 용액으로 방출합니다.
용액을 β-헥소사미니다아제의 형광 기질이 포함된 신선한 멀티웰 플레이트에 수집하고 배양합니다. β-헥소사미니다아제는 기질을 가수분해하여 형광 생성물을 생성합니다. 배양 후 높은 pH 완충액을 첨가하여 β-헥소사미니다제 활성을 억제하고 반응을 중지합니다.
마이크로플레이트 리더를 사용하여 방출된 β-헥소사미니다제 활성을 나타내는 형성된 생성물의 형광을 측정하고 호염기구 탈과립을 유도하는 항원의 알레르기 가능성을 측정합니다.
사전 배양된 Ag8/혈청 현탁액을 원심분리하고, 원심분리된 Ag8/혈청 현탁액 50마이크로리터를 Ag8 세포 펠릿을 방해하지 않고 인간화 RBL 세포를 포함하는 각 웰에 옮깁니다.
항원이 없는 감작되고 자극되지 않은 세포를 하단 신호 고원 또는 배경의 표시를 위한 무항원 대조군으로 사용하고 배경 및 최대 용해 제어 웰을 민감하게 하지 마십시오. 접시를 뚜껑으로 덮고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 7%에서 하룻밤 배양합니다.
혈청 함유 세포 배지를 흡인합니다. 흡수지 위의 플레이트를 뒤집고 두드려 인간화 RBL 세포를 세척하기 위해 플레이트를 비웁니다. 웰당 200마이크로리터의 Tyrode 완충액을 첨가하여 세포를 세 번 세척하고 처음 두 번의 세척 동안 세척당 약 30
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요