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생물학적 기술
0 조회수 • 4:34 분 • July 8th, 2025
디지털 액적 PCR은 인델 돌연변이(DNA의 뉴클레오티드 무작위 삽입 또는 결실)를 검출합니다. 이는 샘플을 작은 물방울로 분할하고 각 물방울의 DNA를 독립적으로 증폭함으로써 달성됩니다.
ddPCR을 수행하려면 표적 유전자의 야생형 및 돌연변이 변이가 포함된 DNA 샘플을 채취합니다. 샘플 혼합물과 오일을 미세유체 채널이 포함된 액적 발생기 챔버의 별개의 구획에 넣습니다.
샘플과 오일은 좁은 채널을 통해 빠르게 흐르고 접합부에서 유화되며 각각 몇 개의 DNA 분자를 포함하는 여러 물방울로 분할됩니다.
이제 정방향 및 역방향 프라이머, dNTP, 열안정성 DNA 중합효소, 서로 다른 형광단 및 소광제 분자로 태그가 지정된 두 개의 프로브가 포함된 완충액이 있는 PCR 플레이트를 가져옵니다. 각 프로브는 특정 유형의 대립유전자(야생형 또는 돌연변이 대립유전자)에 특정합니다.
액적을 PCR 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 열순환기에 넣고 반응을 실행합니다. 변성 중에 DNA 가닥이 분리됩니다. 어닐링 온도에서 프라이머와 프로브는 주형 DNA에 어닐링됩니다.
녹색 및 주황색 형광단을 가진 프로브는 각각 야생형 및 돌연변이 DNA 서열에 결합합니다. 나중에 DNA 중합효소는 프라이머를 확장하여 프로브에서 형광단과 소광제 분자를 절단하여 형광 신호를 생성합니다.
증폭된 생성물을 분석합니다. 녹색 형광을 나타내는 물방울에는 야생형 DNA 서열이 포함되어 있고 주황색 형광은 인델 돌연변이를 나타냅니다.
먼저 ddPCR 슈퍼 믹스, 정방향 및 역방향 프라이머, HEX 또는 FAM 프로브, DNA 및 물을 텍스트에 설명된 비율로 추가하여 25마이크로리터의 디지털 액적 PCR 또는 ddPCR 샘플 믹스를 준비합니다. 그런 다음 소용돌이에 의해 반응을 완전히 혼합합니다.
50마이크로리터 다중 채널 피펫을 사용하여 20마이크로리터의 ddPCR 샘플 혼합물을 카트리지의 중간 줄에 넣습니다. 그런 다음 200마이크로리터 멀티채널 피펫을 사용하여 피펫팅 내내 기포를 발생시키지 않고 70마이크로리터의 오일을 맨 아래 줄에 넣습니다.
중앙의 오목한 부분을 피하고 가장자리만 만지도록 개스킷을 놓은 다음 플레이트를 물방울 발생기에 단단히 놓고 덮개를 닫아 실행을 시작합니다.
카트리지의 맨 윗줄에서 96웰 플레이트로 침지 혼합물을 옮기려면 다중 채널 피펫을 사용하여 30도 내지 45도 각도로 3-5초 동안 40마이크로리터의 액체 샘플을 채취합니다
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