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이중 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)을 사용하면 두 가지 서로 다른 유전자 마커를 동시에 정량적으로 검출할 수 있습니다.
시작하려면 두 개의 서로 다른 표적 서열을 포함하는 샘플을 채취하십시오. 내열성 DNA 중합효소 효소, dNTP 및 표적 특이적 프라이머를 포함하는 혼합물을 첨가합니다. 다음으로, 증폭된 표적을 검출하기 위해 형광 리포터와 소광제 분자로 표지된 두 개의 서로 다른 표적 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가합니다.
용액은 오일로 유화되어 표적 서열을 수많은 나노 방울로 분할합니다. 표적을 포함하는 각 물방울은 개별 반응 용기 역할을 합니다.
개별 나노액적 내부의 증폭 반응을 위한 열 순환 프로세스를 시작합니다.
높은 변성 온도에서 이중 가닥 표적은 단일 가닥으로 분리됩니다.
적절한 어닐링 온도에 도달하도록 온도를 낮추어 프라이머와 올리고뉴클레오티드 프로브가 주형에 결합할 수 있도록 합니다.
소광제의 근접성은 기자의 형광을 억제합니다. 신장 온도에서 DNA 중합효소는 프라이머를 확장하고 올리고뉴클레오티드 프로브를 절단합니다. 결합되지 않은 리포터는 형광을 방출합니다.
방울을 방울 판독기(형광 검출 시스템)를 통과시킵니다. 단일 또는 이중 형광의 검출은 표적을 포함하는 양성 물방울을 나타내고 신호가 없으면 음성 물방울을 나타냅니다.
총 파티션 수에 대한 양성 액적의 비율에 따라 표적 서열의 초기 농도가 결정됩니다.
이 절차를 시작하려면 먼저 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 분자 등급 물의 모든 프라이머에 대해 리터당 100마이크로몰의 스톡 농도를 준비하고 TE pH 8 완충액의 프로브를 준비합니다. 다음으로, 적절한 양의 디지털 PCR 믹스, 정방향 및 역방향 프라이머, 형광 프로브 및 뉴클레아제가 없는 물을 혼합하여 마스터 믹스를 준비합니다. 용액에 기포가 생기지 않도록 주의하면서 위아래로 10회 이상 피펫팅하여 혼합합니다.
dPCR 마스터 믹스는 기존 qPCR 마스터 믹스보다 점성이 높기 때문에 균질한 용액을 생성하기 위해 피펫팅 기술을 통한 혼합을 사용해야 합니다. 이를 통해 다운스트림에서 정확한 dPCR 정량화가 가능합니다.
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중으로 샘플을 실행하기 위한 액적 생성용 분석 혼합물을 만들려면 마스터 믹스 36마이크로리터를 일반 PCR 플레이트에 피펫팅합니다. 36마이크로리터 마스터 믹스 각각에 12마이크로리터의 DNA 주형을 혼합하고 해당 복제 웰을 플레이트에 비워 둡니다. 분석이 제대로 실행되고 있는지 확인하기 위해 양성 대조군을 포함합니다. 템플릿 컨트롤 없음 또는 NTC를 포함하여 플레이트 내에 오염이 없는지 확인하고 나중에 데이터 분석을 위해 형광 기준선을 설정합니다.
액적 발생기를 설정하기 전에 다중 채널 피펫을 사용하여 혼합물을 위아래로 약 15회 피펫팅하여 분석 혼합물을 혼합합니다. 혼합물 내에 과도한 기포가 생기지 않도록 피펫 팁이 액체 안에 있는지 확인하십시오.
그런 다음 8개의 웰이 들어 있는 카트리지 1을 흰색 카트리지 홀더에 삽입하고 카트리지 홀더를 클릭하여 닫습니다. 카트리지 1은 이제 제자리에 단단히 고정되어 물방울을 생성하는 동안 홀더에서 분리될 수 없습니다.
다중 채널 피펫을 사용하여 기포를 발생시키지 않고 '샘플'이라고 표시된 카트리지의 중간 위치로 분석 혼합물 20마이크로리터를 부드럽게 옮깁니다. '오일'이라고 표시된 카트리지 왼쪽에 70마이크로리터의 액적 생성 오일을 피펫팅합니다.
개스킷으로 카트리지를 덮고 개스킷이 평평하고 카트리지 가장자리를 향해 4개의 틱으로 고르게 고정되도록 합니다. 물방울 발생기의 녹색 켜짐 버튼을 눌러 문을 열고 카트리지를 놓습니다. 버튼을 다시 눌러 발전기를 닫습니다. 문이 닫히면 녹색 버튼이 흐리게 되고 문을 다시 열 수 없습니다.
물방울 생성이 즉시 시작되어 약 1분 동안 계속됩니다.
물방울 생성이 진행되는 동안 카트리지 2를 두 번째 흰색 카트리지 홀더에 넣고 카트리지 1과 동일한 방식으로 준비합니다. 물방울 생성이 완료되면 희미한 조명이 켜진 버튼이 녹색으로 바뀝니다.
물방울 발생기 도어를 엽니다. 카트리지가 들어 있는 흰색 카트리지 홀더를 제거하고 따로 보관하십시오. 카트리지 2개를 물방울 발생기에 넣습니다.
카트리지 1에서 개스킷을 제거하고 폐기하십시오. 흰색 카트리지 홀더를 클릭하면 새로 생성된 물방울이 깨질 수 있으므로 클릭을 해제하지 마십시오.
40마이크로리터로 설정된 다중 채널 피펫을 사용하여 팁을 카트리지의 세 번째 열에 45도 각도로 삽입하고 모든 물방울을 천천히 피펫팅합니다. 피펫 팁을 웰 벽에 대고 약 절반 아래로 떨어뜨리고 물방울을 천천히 배출하여 최종 PCR 플레이트로 옮깁니다.
같은 방법으로 카트리지 2의 액적 생성이 완료되면 카트리지 2에서 개스킷을 제거하고 생성된 액적을 최종 PCR 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 위에 구멍을 뚫을 수 있는 호일 커버를 놓고 플레이트 실러 위에 놓습니다. 실러를 섭씨 180도로 설정합니다. 실러의 "재생"을 누르고 10초 동안 밀봉합니다.
이 절차를 시작하려면 밀봉된 최종 PCR 플레이트를 열 순환기에 넣습니다. 최종 PCR 플레이트와 호환되고 온도 램프 속도가 초당 섭씨 2도인 열 순환기를 사용하십시오.
섭씨 95도에서 10분, 섭씨 94도에서 30초, 섭씨 60도에서 60초씩 40주기, 섭씨 98도에서 10분 동안 유지하는 열 프로그램을 실행합니다. 사이클링이 완료되면 플레이트를 액적 판독기로 옮겨 각 웰의 각 액적에서 형광을 자동으로 측정합니다.
물방울 판독을 진행하기 전에 물방울이 실온에 있는지 확인하십시오. 함께 제공되는 소프트웨어를 열어 물방울 판독을 설정하는 것부터 시작하십시오. 빈 96웰 플레이트의 회로도가 포함된 기본 "설정" 메뉴에서 웰 A1을 두 번 클릭하여 "샘플", "분석 1" 및 "분석 2"의 세 섹션이 포함된 메뉴를 엽니다.
샘플 섹션에서 "이름"이라고 표시된 상자에 샘플 ID를 입력하고 오른쪽에 "적용"이라고 표시된 상자를 선택합니다. 그런 다음 "실험"이라고 표시된 드롭다운 메뉴를 클릭합니다. 희귀 이벤트 감지에 대해 "빨간색"을 선택하고 'Enter'를 클릭합니다.
"A1"로 표시된 섹션으로 이동합니다. "이름" 섹션에서 분석을 작성하고 'Enter'를 클릭합니다. 아래 "유형"이라고 표시된 상자에서 드롭다운 메뉴를 클릭하고 "Channel 1 Unknown"을 선택한 다음 'Enter'를 클릭합니다.
"A2"로 표시된 섹션으로 이동합니다. "이름" 섹션에서 분석을 작성하고 'Enter'를 클릭합니다. 아래 "유형"이라고 표시된 상자에서 드롭다운 메뉴를 클릭하고 "알 수 없는 채널 2"를 선택한 다음 'Enter'를 클릭합니다.
이전 단계의 모든 정보는 이제 A1 웰에 있습니다.
물방울이 포함된 모든 후속 웰의 이름을 지정합니다. 총 설정 시간을 절약하려면 'Shift' 또는 'Control'을 클릭하여 여러 웰을 동시에 선택합니다. 플레이트의 디지털 묘사가 실제 플레이트를 반영하면 메뉴 오른쪽 하단에 있는 "확인"을 누릅니다. 플레이트 회로도 상단에 나타나는 새 메뉴의 "템플릿" 섹션에서 "다른 이름으로 저장"을 선택하고 플레이트의 이름을 지정하고 저장합니다.
화면 왼쪽의 "실행"을 클릭하고 팝업 "실행 옵션" 창에서 적절한 염료 세트를 선택합니다. 데이터 수집이 시작되고 소프트웨어에 실시간으로 표시됩니다.