이중 유전자 마커의 동시 정량을 위한 Duplex Digital PCR

이중 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)을 사용하면 두 가지 서로 다른 유전자 마커를 동시에 정량적으로 검출할 수 있습니다.

시작하려면 두 개의 서로 다른 표적 서열을 포함하는 샘플을 채취하십시오. 내열성 DNA 중합효소 효소, dNTP 및 표적 특이적 프라이머를 포함하는 혼합물을 첨가합니다. 다음으로, 증폭된 표적을 검출하기 위해 형광 리포터와 소광제 분자로 표지된 두 개의 서로 다른 표적 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가합니다.

용액은 오일로 유화되어 표적 서열을 수많은 나노 방울로 분할합니다. 표적을 포함하는 각 물방울은 개별 반응 용기 역할을 합니다.

개별 나노액적 내부의 증폭 반응을 위한 열 순환 프로세스를 시작합니다.

높은 변성 온도에서 이중 가닥 표적은 단일 가닥으로 분리됩니다.

적절한 어닐링 온도에 도달하도록 온도를 낮추어 프라이머와 올리고뉴클레오티드 프로브가 주형에 결합할 수 있도록 합니다.

소광제의 근접성은 기자의 형광을 억제합니다. 신장 온도에서 DNA 중합효소는 프라이머를 확장하고 올리고뉴클레오티드 프로브를 절단합니다. 결합되지 않은 리포터는 형광을 방출합니다.

방울을 방울 판독기(형광 검출 시스템)를 통과시킵니다. 단일 또는 이중 형광의 검출은 표적을 포함하는 양성 물방울을 나타내고 신호가 없으면 음성 물방울을 나타냅니다.

총 파티션 수에 대한 양성 액적의 비율에 따라 표적 서열의 초기 농도가 결정됩니다.

이 절차를 시작하려면 먼저 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 분자 등급 물의 모든 프라이머에 대해 리터당 100마이크로몰의 스톡 농도를 준비하고 TE pH 8 완충액의 프로브를 준비합니다. 다음으로, 적절한 양의 디지털 PCR 믹스, 정방향 및 역방향 프라이머, 형광 프로브 및 뉴클레아제가 없는 물을 혼합하여 마스터 믹스를 준비합니다. 용액에 기포가 생기지 않도록 주의하면서 위아래로 10회 이상 피펫팅하여 혼합합니다.

dPCR 마스터 믹스는 기존 qPCR 마스터 믹스보다 점성이 높기 때문에 균질한 용액을 생성하기 위해 피펫팅 기술을 통한 혼합을 사용해야 합니다. 이를 통해 다운스트림에서 정확한 dPCR 정량화가 가능합니다.

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중으로 샘플을 실행하기 위한 액적 생성용 분석 혼합물을 만들려면 마스터 믹스 36마이크로리터를 일반 PCR 플레이트에 피펫팅합니다. 36마이크로리터 마스터 믹스 각각에 12마이크로리터의 DNA 주형을 혼합하고 해당 복제 웰을 플레이트에 비워 둡니다. 분석이 제