바이러스 감염 진단을 위한 Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR

실시간 정량적 역전사 PCR은 바이러스 감염을 식별하는 데 유용합니다.

표적 바이러스 RNA를 포함하는 샘플로 시작합니다. DNA 합성 및 증폭을 모두 돕는 표적 특이적 프라이머를 역전사 효소 및 dNTP와 함께 추가합니다.

PCR 주기 전반에 걸쳐 DNA를 증폭하는 효소인 열안정성 DNA 중합효소와 이중 가닥 DNA, dsDNA에 삽입되는 염료인 SYBR green을 추가합니다. 반응을 열 순환기에 넣습니다. 프라이머가 표적 RNA에 결합할 수 있는 적절한 온도를 설정합니다.

역전사 효소는 프라이머에 dNTP를 추가하는 동시에 주형 RNA를 절단하여 cDNA를 합성합니다.

온도를 높여 역전사 효소를 비활성화합니다. 온도를 낮추어 프라이머가 후속 증폭을 위해 cDNA에 어닐링되도록 합니다. DNA 중합효소가 프라이머를 확장하여 dsDNA를 합성하는 확장 단계에 도달하기 위해 온도를 높입니다.

연속 주기는 기하급수적인 dsDNA 증폭을 초래합니다. SYBR 녹색은 점점 더 많은 수의 DNA에 결합하여 형광 방출을 비례적으로 증가시킵니다. 사이클 전반에 걸쳐 검출된 형광 신호를 플로팅합니다.

양성 증폭 곡선은 샘플에 바이러스 RNA가 존재함을 나타냅니다.

용융 온도에 도달하기 위해 온도를 점진적으로 높이고 dsDNA를 단일 가닥으로 변성시킵니다. 결합된 염료 분자는 방출되어 형광을 잃습니다. 온도에 대한 형광 감소를 그립니다.

바이러스 특이적 용융 온도에 해당하는 피크는 바이러스 감염을 확인합니다.

테스트 샘플과 대조 샘플을 모두 고려하여 스프레드시트를 사용하여 PCR 플레이트의 레이아웃을 계획합니다. 표면을 소독하여 PCR 워크스테이션을 준비하고, UV 캐비닛을 사용하는 경우 시작하기 10분 전에 UV 조명을 켜십시오.

동실에서 시약과 프라이머를 꺼내 해동하되 효소 혼합물은 항상 얼음 위에 보관하십시오. 시약을 혼합하고 잠시 원심분리하여 액체를 수집합니다. 원고 지침에 따라 리사바이러스 및 베타-액틴에 대한 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 사용할 준비가 될 때까지 마스터 믹스를 얼음 위에 그대로 두십시오. 준비된 마스터 믹스를 혼합 및 원심분리한 다음 19마이크로리터를 PCR 기계 호환 플레이트 또는 튜브 스트립의 관련 웰에 분배합니다.

별도의 방이나 UV 캐비닛에 준비된 RNA 1마이크로리터를 조심스럽게 추가합니다. UV 캐비닛을 사용하는 경우 시작하기 10분 전에 UV 조명을 켜십시오. 테스트 샘플 후에 양성 대조군과 템플릿 없음 대조군을 추가합니다.

RNA를 마스터 믹스에 추가할 때 올바른 웰에 추가되었는지 확인하십시오. 이 단계를 돕기 위해 플레이트 계획을 사용하십시오.

접시를 밀봉하여 뚜껑이 접시를 가로질러 평평한지 확인하고 아래로 돌려 우물 바닥에 있는 모든 액체를 모으십시오. 각 우물에 동일한 양의 액체가 있고 기포가 보이지 않는지 확인하십시오. 그런 다음 샘플을 PCR 기계로 옮깁니다.

프로그램을 열고 '해리'와 함께 'SYBR Green'을 선택합니다. 분석할 웰을 선택하고 샘플 유형으로 "알 수 없음"을 선택하고 형광 염료로 "SYBR"을 선택합니다. 플레이트 레이아웃의 웰에 리사바이러스 웰 또는 베타-액틴에 대한 분석인지 여부를 포함한 샘플 정보로 라벨을 붙입니다.

"열 프로파일 설정"을 클릭하고 원고에 지정된 대로 열 순환 조건을 수정합니다. "시작"을 클릭한 다음 파일을 저장할 위치를 선택하고 실행이 끝날 때 램프를 끄는 확인란을 선택합니다. 램프 예열 전에 시작하는 옵션이 나타나면 "지금 실행"을 클릭하되 램프가 예열하는 데 15분 미만이 있는지 확인하십시오.