박테리오파지를 열거하기 위한 정량적 중합효소 연쇄 반응(Quantitative Polymerase Chain Reaction to Enumerate Bacteriophage)

0 조회수3:25 • July 8th, 2025

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정량적 중합효소 연쇄 반응, qPCR을 통해 박테리오파지를 열거하려면 최적화된 완충액에 Taq DNA 중합효소, 프라이머, 데옥시뉴클레오티드 삼인산염(dNTP) 및 형광 리포터 염료 분자를 포함하는 qPCR 반응 칵테일을 얻습니다. qPCR 플레이트의 웰로 옮깁니다.

열처리된 박테리오파지를 첨가합니다. 열처리는 박테리오파지 입자에서 박테리오파지 DNA를 방출합니다. 혼합물 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하십시오. 플레이트를 qPCR 시스템에 로드하고 적절한 사이클링 조건을 설정합니다.

고온으로 가열하면 이중 가닥 DNA가 단일 가닥으로 변성됩니다. 또한 Taq DNA 중합효소를 활성화합니다. 어닐링은 서열 특이적 프라이머가 상보적인 박테리오파지 DNA 가닥에 결합하도록 합니다. 확장을 통해 활성화된 Taq DNA 중합효소는 프라이머의 3' 말단에 dNTP를 추가하여 성장하는 DNA 가닥을 5'에서 3' 방향으로 확장할 수 있습니다.

염료 분자는 새로 합성된 이중 가닥 DNA에 삽입되어 형광 강도가 증가합니다. 각 PCR 주기는 표적 DNA 양을 두 배로 늘려 형광 강도를 증가시킵니다.

측정된 형광이 배경 수준을 초과하는 임계값 주기 Ct 값을 결정합니다.

Ct 값은 시작 DNA 양과 반비례하며, 각 박테리오파지 게놈은 하나의 박테리오파지 입자와 동일하므로 박테리오파지 DNA 표준 곡선에서 박테리오파지 정량화가 용이합니다.

증폭 후 용융 곡선 분석을 수행하여 반응 온도를 점차적으로 높입니다. 특정 용융 온도에서 DNA의 절반이 단일 가닥으로 분리되어 염료 분자를 방출하고 갑작스러운 형광 감소를 유발합니다.

qPCR 산물에 고유한 고유한 용융 온도는 산물의 특이성을 검증합니다.

농도를 알 수 없는 10개의 바이오패닝된 파지 샘플과 표준 농도의 7개 샘플에 대해 qPCR 프리믹스를 세 번 준비하면 255마이크로리터의 qPCR 마스터 믹스, 51마이크로리터의 프라이머 및 102마이크로리터의 물을 포함하는 51개의 샘플에 대한 프리믹스가 생성됩니다.

준비된 PCR 혼합물 8마이크로리터를 96웰 qPCR 플레이트의 51웰에 분취합니다. 다음으로, 2마이크로리터의 열처리된 T7 파지 샘플을 이러한 각 웰에 추가하여 qPCR 프리믹스 표면 아래에 분배합니다. 접착 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다.

형광 광표백을 최소화하기 위해 플레이트를 알루미늄 호일로 감싼 다음 qPCR 장비에서 플레이트를 실행합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 사이클링 조건 및 용융 곡선 설정을 설정합니다.

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마지막 업데이트: 22 8월 2026