돌연변이 DNA 염기서열의 염기서열 변화를 결정하기 위한 고분해능 용융 PCR

고분해능 용융 중합효소 연쇄 반응인 HRM-PCR은 이중 가닥 DNA, dsDNA 서열 변이를 높은 정밀도로 검출합니다.

비활성 Taq 중합효소, 데옥시리보뉴클레오티드 삼인산(dNTP) 및 형광 리포터 염료를 포함하는 마스터 믹스로 시작합니다. 정방향 및 역방향 프라이머를 추가합니다. 혼합물을 PCR 플레이트의 웰에 피펫팅합니다.

dsDNA 템플릿을 추가합니다. 혼합물 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하십시오. PCR을 시작합니다.

높은 변성 온도는 dsDNA를 단일 가닥 DNA, ssDNA로 변성시키고 중합효소를 활성화합니다. 그런 다음 반응을 어닐링 온도로 냉각하여 부위 특이적 상보적 염기 쌍을 통해 ssDNA에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 결합을 촉진합니다.

활성화된 중합효소가 모집되어 dNTP 추가에 의해 DNA-프라이머 이중체를 확장합니다.

포화 농도로 존재하는 dsDNA 특이적 염료인 형광 리포터 염료는 전체 듀플렉스 내에 삽입되어 밝게 형광을 발합니다. 듀플렉스는 여러 번의 PCR 주기를 거쳐 여러 변이체 함유 단편을 생성합니다.

PCR 후, 시간이 지남에 따라 반응 온도를 꾸준히 다시 상승시켜 용융 곡선 분석을 수행합니다.

뉴클레오티드 서열에 따라 변이체 함유 부위가 먼저 변성되어 염료를 방출할 수 있습니다. 나머지 염료 결합 부위가 포화되면 염료가 다시 삽입되지 않아 형광 강도가 감소합니다. 또한, dsDNA는 점진적으로 가열하면 ssDNA로 해리됩니다.

dsDNA의 절반이 급격한 형광 감소와 함께 ssDNA로 변성되는 용융 온도를 식별합니다. 증폭된 DNA 단편의 용융 곡선의 이동은 샘플의 뉴클레오티드 서열 변이를 식별합니다.

HRM-PCR 프로토콜을 수행하려면 먼저 1.5밀리리터 튜브에 담긴 DNA 샘플을 마이크로리터당 10나노그램의 농도로 희석합니다. 다음으로, 해동된 프라이머 용액을 1.5밀리리터 튜브에 물과 함께 동일한 농도의 6마이크로몰로 희석합니다. HRM-PCR 키트 용액을 해동하고 모든 내용물을 회수할 수 있도록 와류를 통해 조심스럽게 혼합합니다.

DNA 결합 염료, 염화마그네슘 및 물과 효소 혼합물이 들어 있는 3개의 바이알을 개봉하기 전에 미세 원심분리기에서 잠깐 회전시킵니다. 실온에서 1.5밀리리터 튜브에서 구성 요소를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 120마이크로리터 반응을 위한 PCR 혼합물을 준비합니다. 소용돌이로 조심스럽게 섞는다.

분자 생물학의 모범