백혈구에서 DNA 메틸화를 검출하기 위한 다중 액적 중합효소 연쇄 반응

DNA 시토신 잔기 메틸화는 백혈구 또는 백혈구의 특징입니다.

다중 액적 중합효소 연쇄 반응(mdPCR)을 사용하면 백혈구 내에서 여러 메틸화된 DNA 영역을 동시에 식별할 수 있습니다.

반응 완충액, DNA 중합효소 및 뉴클레아제가 없는 물을 포함하는 혼합물을 준비합니다. 각 표적 영역에 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머와 형광 가수분해 프로브를 추가합니다. 프로브는 형광 방출을 억제하기 위해 소광제에 결합된 다양한 색상의 형광단 리포터로 구성됩니다.

메틸화되지 않은 시토신은 변하지 않는 동안 우라실로 탈아미노화되는 중아황산염 전환 DNA를 추가합니다. 섞다.

유리 주사기에 캐리어 오일-계면활성제 혼합물을 채우고 다른 주사기에 캐리어 오일-PCR 혼합물을 채우고 미세유체 액적 발생기에 연결합니다. 캐리어 오일-수성 PCR 혼합물은 나노리터 이하의 물방울로 유화됩니다. 계면활성제는 에멀젼을 안정화시키고 액적 합류를 방지합니다.

액적을 수집하고 PCR을 수행합니다. 각 액적 내에서 높은 변성 온도는 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 변성시키고 중합효소를 활성화합니다. 반응 온도가 낮아져 프라이머와 프로브의 부위별 어닐링이 가능합니다.

중합효소가 DNA-프라이머 듀플렉스에 결합하고 확장함에 따라 우라실은 티민으로 증폭되는 반면, 메틸화된 시토신은 사이토신으로 증폭되어 메틸화된 영역과 메틸화되지 않은 영역을 구별할 수 있습니다. 중합효소는 프로브에서 리포터를 추가로 절단하고 방출하여 형광 방출을 일으

킵니다.

PCR 후 현미경으로 방울을 시각화합니다. 형광 색상은 특정 메틸화된 DNA 표적의 존재를 나타냅니다.

액적 생성을 위해 1마이크로리터의 중아황산염 전환 DNA를 PCR 튜브에서 새로 준비된 프로브 마스터 믹스와 혼합하고 간단한 원심분리를 통해 샘플을 수집합니다. PEEK 피팅을 사용하여 일회용 유체 튜브를 250마이크로리터 용량의 정밀 유리 주사기 2개에 연결하고, 5% 불소 계면활성제를 함유한 250마이크로리터의 캐리어 오일로 정밀 유리 주사기 1개와 50마이크로리터의 캐리어 오일을 담은 정밀 유리 주사기 1개를 미리 채웁니다.

두 주사기가 모두 로드되면 100마이크로리터의 PCR 혼합물을 캐리어 오일 주사기에 로드하고 액적 미세유체 장치를 고속 카메라가 장착된 정립 광학 현미경의 스테이지에 놓습니다.

액적 형성을 실시간으로 관찰하고 기록하려면 미리 채워진 주사기를 프로그래밍 가능한 주사기 펌프에 놓고 피팅이 있는 PEEK 유니온을 사용하여 주사기의 튜브를 액적 미세유체 장치의 각 입구 채널의 튜브에 연결합니다.

액적 발생기의 출구에서 0.5밀리리터 PCR 튜브 내부로 튜브를 놓고 주사기 펌프 유량을 분당 2마이크로리터로 조정합니다. 결과 에멀젼을 수집하기 전에 물방울 크기가 안정화되도록 하십시오. 튜브 상단에서 에멀젼을 천천히 조심스럽게 수집하고 열 순환을 위해 75마이크로리터의 용액을 200마이크로리터 PCR 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 PCR 튜브의 오일 함량이 분산상의 부피와 밀접하게 일치하는지 확인하여 열 순환 중 액적의 유착을 방지하고 200마이크로리터 튜브를 열 순환기에 넣습니다.