나노유체 칩을 사용하여 희귀한 전사체 변이체를 검출하는 칩 기반 디지털 PCR

칩 기반 디지털 PCR 기술은 단일 반응을 나노유체 칩의 챔버로 분할합니다. 분할된 서열의 증폭을 통해 희귀 전사체 변이체(낮은 빈도로 발생하는 비표준 전사체)를 검출할 수 있습니다.

시작하려면 표적 희귀 전사체 변이체와 일반 변이체의 cDNA를 포함하는 샘플을 채취합니다. 열안정성 DNA 중합효소, dNTP 및 프라이머를 포함하는 용액을 추가합니다.

다양한 형광 리포터 및 소광제 분자로 표지된 일반적이고 희귀한 전사체 변이체 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가합니다. 소광제는 가까이 있을 때 리포터의 형광을 흡수합니다.

혼합물을 나노유체 칩에 로드합니다. 용액은 균일 한 크기의 나노 챔버로 분할됩니다. cDNA를 포함하는 각 챔버는 독립적인 반응 용기 역할을 합니다.

열 순환 프로세스를 시작합니다. 높은 변성 온도는 이중 가닥 DNA를 단일 가닥으로 분리합니다. 온도를 낮추어 프라이머와 올리고뉴클레오티드 프로브가 단일 DNA 가닥의 상보적 영역에 어닐링되도록 합니다.

DNA 중합효소가 프라이머를 확장하고 프로브를 절단하는 확장 단계에 도달하기 위해 온도를 높입니다. 소광기와의 거리는 리포터의 형광 방출을 가능하게 합니다. 형광 신호를 읽습니다.

증폭된 희귀 전사체 표적이 있는 챔버와 표적이 없는 챔버를 나타내는 산점도를 만듭니다. 표적에 대한 양성 신호는 샘플에 희귀 전사체 변이체가 존재함을 나타냅니다.

시작하려면 마스터 믹스와 분석을 실온에서 최소 20분 동안 해동시킵니다. 그런 다음 0.5밀리리터 튜브에 cDNA 샘플의 6마이크로리터 분취량을 로드합니다. 또한 템플릿이 없는 컨트롤 튜브를 만드십시오. 다음으로, 마스터 믹스를 부드럽게 소용돌이치고 반응당 8.7마이크로리터를 멸균 튜브에 분취합니다.

그런 다음 각 반응에 대해 0.87마이크로리터의 맞춤형 분석 프라이머를 추가하고 1.83마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다. 조합을 부드럽게 혼합하고 11.4마이크로리터를 cDNA가 포함된 각 튜브와 주형 없음 대조군으로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 부드럽게 혼합하고 펄스 원심분리를 사용하여 튜브 내용물을 모으십시오. 최적의 결과를 얻으려면 가능한 한 빨리 칩을 로드하십시오.

칩 로더를 연결하고 표시등이 녹색으로 바뀔 때까지 기다립니다. 그런 다음 플런저를 1-2mm까지 부드럽게 당겨 침지 유체 주사기를 준비한 다음 캡을 제거하고 팁을 추가합니다.

그런 다음 새 칩의 뚜껑에 적힌 코드를 기록한 다