단핵구 분리에 음성 선택법이 선호되는 이유는 무엇인가요?

음성 선택(Negative selection)은 단구(monocyte)의 직접적인 표지를 피함으로써 표면 마커의 무결성과 다운스트림 분석을 위한 기능적 준비 상태를 보존합니다. 이 방법은 활성화 아티팩트를 줄이고 면역 기능 연구에서 생리학적 관련성을 유지합니다.

Fc 수용체 차단이 분리 특이성을 어떻게 향상시키나요?

Fc 수용체 차단 항체는 면역글로불린 복합체가 단핵구에 비특이적으로 결합하는 것을 방지하여, 표적 세포군의 잘못된 제거를 줄여줍니다. 이 단계는 단핵구가 아닌 세포들만 자기 제거를 위해 표지되도록 함으로써 특이성을 높여줍니다.

분리 성공 여부를 평가할 수 있는 정량적 출력값은 무엇입니까?

CD14+CD16- 단핵구 마커에 대한 유세포 분석을 통해 평가한 분리 후 생존율, 수율 및 순도는 성공 여부를 판단하는 정량적 기준을 제공합니다. 이러한 지표를 통해 공여자 및 처리 조건 간의 비교가 가능하며 이를 통해 일관성을 확보할 수 있습니다.

자기 분리 과정에서 반복 단계가 중요한 이유는 무엇입니까?

자기 분리 단계를 반복하면 이전 단계에서 제거되지 않은 잔류 오염 세포를 제거함으로써 단핵구 집단을 점진적으로 농축할 수 있습니다. 이러한 반복적 접근 방식은 최종 순도를 높이고 분리 간의 변동성을 줄여줍니다.

이 분리 방법을 시행하기 전에 어떤 분석 역량이 필요한가요?

단핵구 표현형 분석을 위한 유세포 분석, 생존능 분석 및 세포 형태의 시각적 평가를 위한 현미경 관찰은 분리 품질을 검증하는 데 필수적입니다. 이러한 도구들은 분리된 세포 집단이 후속 분석에 사용하기 위한 순도 및 기능적 표준을 충족하는지 확인해 줍니다.

면역자기 음성 선택에 의한 전혈에서 단핵구의 분리

JoVE Encyclopedia of Experiments

면역학

0 조회수 • 4:27 분 • July 8th, 2025

면역자기 음성 선택에 의해 전혈에서 백혈구의 일종인 단핵구를 분리하기 위해 튜브에 항응고제 처리된 인간 혈액을 얻습니다. Fc 수용체 차단 항체와 이중특이성 사량체 항체 복합체를 포함하는 항체 칵테일 용액을 추가합니다.

각 항체 복합체는 2개의 단클론 항체로 구성되며, 하나는 백혈구 및 적혈구를 포함한 비단핵구 세포의 세포 표면 항원에 특이적인 항체이고 다른 항체는 덱스트란에 특이적입니다.

덱스트란 코팅 마그네틱 비드 용액을 추가합니다. 인큐베이트. Fc 수용체 차단 항체는 단핵구의 Fc 수용체에 결합하여 단클론 항체의 비특이적 결합을 방지합니다.

항체 복합체의 단클론 항체는 비단핵구 세포의 특정 세포 표면 항원을 인식하고 결합하여 단핵구를 표지하지 않은 상태로 둡니다. 덱스트란으로 코팅된 마그네틱 비드는 항체 복합체의 항-덱스트란 항체에 결합하여 비단핵구 세포를 비드에 가교합니다.

튜브를 마그네틱 홀더에 놓습니다. 높은 구배 자기장의 영향으로 자기 비드 가교 세포는 튜브 벽에 결합하여 단핵구를 튜브 중앙에 남깁니다.

단핵구 함유 용액을 피펫팅하고, 새 튜브로 옮깁니다. 마그네틱 비드를 추가하여 남아 있는 원치 않는 세포를 가교합니다. 자기장의 영향 하에 두어 단핵구 개체군을 풍부하게 합니다.

단핵구 현탁액을 새 튜브로 옮깁니다. 현탁액을 원심분리합니다. 추가 분석을 위해 단핵구를 완충액에 재현탁합니다.

개의 10밀리리터 EDTA 진공관에 40밀리리터의 신선한 인간 전혈을 채취한 후 멸균 기술을 사용하여 모든 혈액을 생물 안전 캐비닛의 단일 50밀리리터 원추형 프로필렌 튜브로 옮깁니다. 선택한 인간 단핵구 분리 키트의 제조업체 지침에 따라 키트의 단핵구 분리 칵테일 2밀리리터를 혈액관에 넣고 키트의 자기 비드를 30초 동안 소용돌이치

게 합니다.

혈액에 2mm의 구슬을 넣고 25ml 혈청학적 피펫을 사용하여 구슬을 혈액과 조심스럽게 혼합합니다. 실온에서 5분 후, 혈액을 4개의 50밀리리터 튜브에 균등하게 나누고 각 튜브에 1밀리몰 EDTA가 보충된 멸균 PBS 30밀리리터를 추가합니다. 플라스틱 25밀리리터 혈청학적 피펫과 다시 혼합하고 튜브를 마그네틱 홀더에 넣습니다.

10분 후 피펫을 사용하여 적혈구가 1밀리리터 이상 흡인되지 않도록 주의하면서 각 튜브 중앙에서 내용물을 흡입한 다음 튜브 내용물을 4개의 새 50밀리리터 튜브 중 하나에 분배합니다. 각 튜브에 500마이크로리터의 소용돌이 자기 비드를 추가하고 세포 용액을 부드럽게 혼합합니다. 튜브를 마그네틱 홀더에 5분 동안 다시 넣은 후 각 튜브 중앙에서 내용물을 4개의 새 50mm 튜브 중 하나로 조심스럽게 옮깁니다.

모든 세포 현탁액이 옮겨지면 각각의 새 50밀리리터 튜브를 자석 홀더에 5분 동안 넣은 후 튜브 내용물을 4개의 새로운 50밀리리터 튜브로 구성된 세 번째 세트로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 원심분리를 통해 세포를 수집하고 계수를 위해 총 10밀리리터의 멸균 PBS에 4개의 세포 펠릿을 모두 재현탁합니다.