표적 화학물질의 영향을 연구하기 위한 비만 세포 탈과립 분석

비만 세포 — 특수한 백혈구에는 베타-헥소사미니다제와 같은 리소좀 효소가 풍부한 분비 과립이 포함되어 있습니다.

비만 세포 탈과립(분비 과립의 방출과 관련된 과정)을 수행하려면 면역글로불린으로 전처리된 쥐 복막 비만 세포 현탁액이 포함된 멀티웰 플레이트로 시작합니다.

표적 화학 물질로 세포를 처리합니다. 자극 가능성이 있는 표적 화학 물질은 비만 세포의 특정 수용체에서 사전 결합된 면역글로불린과 상호 작용합니다. 이것은 베타-헥소사미니다제를 함유한 과립이 세포 표면으로의 이동을 활성화하여 용액으로 방출합니다.

플레이트를 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 효소 함유 상청액을 신선한 플레이트의 빈 웰로 옮깁니다. 세포 펠릿을 용해 완충액으로 처리하여 세포를 용해하고 세포내 베타-헥소사미니다아제를 포함한 내용물을 용해물로 방출합니다.

효소 함유 용해물을 동일한 멀티웰 플레이트의 다른 웰에 첨가합니다. 효소의 기질인 p-니트로페닐-아세틸-D-글루코사민으로 두 웰을 모두 처리하고 배양합니다. 효소는 기질을 가수분해하여 용액을 노란색으로 만드는 유색 제품인 p-니트로페놀을 방출합니다.

알칼리성 정지 용액으로 웰을 오버레이하여 반응을 종료하고 p-니트로페놀을 p-니트로페놀레이트로 전환하여 노란색 착색을 강화합니다. 분광 광도계는 405나노미터에서 두 웰에 대한 용액의 흡광도를 추정합니다.

비만 세포 탈과립에 대한 표적 화학 물질의 자극 효과와 상관관계가 있는 효소의 방출 비율을 계산합니다.

베타-헥소사미니다제 방출을 측정하려면 웰당 100마이크로리터의 세포 현탁액을 96웰 V-바닥 웰 플레이트로 옮깁니다. 각 웰에 25마이크로리터의 자극 또는 대조 용액을 추가합니다. 그런 다음 세포를 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 96웰 플레이트를 얼음 위에 5분 동안 놓아 반응을 중지합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 4도에서 120g에서 4분 동안 원심분리합니다.

120마이크로리터의 상청액을 바닥이 평평한 96웰 플레이트에 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 세포 알갱이를 만지지 않도록 조심스럽게 피하되 상청액을 완전히 흡인하십시오. 다음으로, 125마이크로리터의 용해 완충액을 세포 펠릿에 첨가합니다. 세포 펠릿을 실온에서 5분 동안 배양하고, 배양 후 반복적인 피펫팅으로 재현탁합니다.

새로운 평평한 바닥 96웰 플레이트의 필요한 웰에 25마이크로리터의 4밀리몰 pNAG 용액을 피펫팅합니다. 각 상청액 25마이크로리터와 각