Mouse Kupffer 세포의 분리 및 배양

Kupffer 세포는 간 정현파에 국한된 상주 대식세포로 감염으로부터 간을 보호하는 데 도움이 됩니다.

마우스 Kupffer 세포를 분리하려면 배지 함유 접시에 갓 수확한 관류 마우스 간을 섭취하십시오. 콜라게나제를 사용한 간 관류 단계는 세포외 기질을 소화하여 간 세포 해리를 일으킵니다.

간피막을 파열시켜 실질 세포, PC 및 비실질 세포, Kupffer 세포, 내피 세포, 성상 세포 및 나머지 적혈구를 포함한 NPC를 포함한 해리된 간 세포를 방출합니다.

이물질을 제거하기 위해 필터를 사용합니다. 여과액에 저속 차등 원심분리를 수행하여 PC를 선택적으로 침전시킵니다. NPC 함유 상청액을 수집합니다. 원심분리하여 세포를 농축합니다.

세포를 배지에 재현탁하고 밀도가 다른 두 개의 구배 배지 층으로 불연속적인 등장 밀도 구배에 층을 층으로 층을 이룹니다. 원심분리를 통해 세포는 구배 배지에 대한 밀도에 따라 분리됩니다.

기울기 층 간기에서 농축된 NPC 층을 수집합니다. 배지 함유 튜브 및 원심분리기로 옮깁니다. 재현탁된 NPC를 멀티웰 플레이트에 시드합니다.

몇 분 안에 현탁액의 Kupffer 세포는 플라스틱 웰 표면에 쉽게 부착되는 반면 다른 NPC는 배지에 남아 있습니다. Kupffer 세포 성장을 지원하기 위해 배지를 신선한 배지로 교체하십시오.

Kupffer 세포를 정제하려면 관류된 간 1개를 15밀리리터의 Kupffer 세포 분리 배지와 함께 페트리 접시에 넣습니다. 가위나 핀셋을 사용하여 Glisson's 캡슐을 파열시키고 모든 간 세포를 배지로 방출합니다. 100마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 용액을 원심분리기 튜브로 여과합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 50g에서 2분 동안 원심분리합니다.

실질 세포는 펠릿에 있고 비실질 세포는 상청액에 있습니다. 깨끗한 원심분리기 튜브에 상청액을 모아 50g에서 2분 동안 원심분리합니다. 총 4번의 전송과 스핀을 반복합니다.

다음으로, 상청액을 1,350g에서 15분 동안 원심분리하여 비실질 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 10밀리리터의 Kupffer 세포 분리 배지에 재현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 미리 준비된 불연속 25/50% 등장성 구배에 비실질 세포 용액을 첨가하고 가속이나 중단 없이 15분 동안 850g에서 원심 분리합니다.

10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 25/50% SIP 계면에 가까운 25% SIP 분획