Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells into Macrophages

성체 체세포는 줄기 세포와 유사한 미분화 및 증식 상태를 나타내는 유도만능줄기세포(iPSC)를 얻기 위해 유전적으로 재프로그래밍될 수 있습니다.

인간 iPSC를 대식세포(병원체와 세포 파편을 식균하는 백혈구)로 분화하려면 비세포 접착 표면이 있는 배양 플레이트부터 시작합니다.

성장 인자 뼈 형성 단백질, 줄기 세포 인자 및 혈관 내피 성장 인자를 포함하는 배지를 추가합니다. iPSC를 시종하고 배양합니다.

비접착성 표면은 iPSC 부착을 방지하고 세포를 현탁액으로 유지하여 3차원 배아체(EB)로의 응집을 촉진합니다. 성장 인자는 EB 내에서 중배엽 계통 세포로의 iPSC 분화를 시작합니다.

분화된 EB를 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 중력을 통해 정착하도록 하십시오. 인터루킨-3, IL3 및 대식세포 콜로니 자극 인자인 CSF1을 포함하는 신선한 배지에 EB를 재현탁합니다. 젤라틴 코팅된 세포 배양 플레이트에 EB를 플레이트합니다.

세포외 기질 단백질인 젤라틴은 EB 부착을 촉진합니다. IL3는 EB가 조혈모전구세포로 분화하도록 자극하여 골수세포를 생성합니다. CSF1은 골수 세포 증식과 배지에서 방출되어 현탁 상태로 남아 있는 대식세포 전구체로의 분화를 지원합니다.

현탁 세포를 수집하고 원심분리합니다. CSF1 보충 배지에 세포를 재현탁합니다.

코팅되지 않은 배양 플레이트에 세포를 도금합니다.

CSF1은 대식세포 전구체를 완전한 기능의 부착성 성숙 대식세포로 말단 분화를 유도합니다.

0일에 분화 과정을 시작하려면 2.25밀리리터의 1단계 배지를 초저부착 6웰 플레이트의 두 웰에 추가합니다. 그런 다음 6웰 플레이트에서 iPSC의 180% 컨플루언트 웰의 경우 유지 배지를 1.5밀리리터의 1단계 배지로 교체합니다. 새로운 세포 계대 도구를 사용하여 콜로니를 절단합니다. 피펫을 사용하여 절단된 콜로니를 초저부착 6웰 플레이트의 두 웰로 옮깁니다.

2일째에 0.5밀리리터의 hESC-SFM 배지를 2일째 배아체를 포함하는 6웰 웰 플레이트에 추가하여 사이토카인 농도를 조정합니다.

4일째에 6웰 조직 배양 플레이트의 4웰을 0.1% 젤라틴으로 코팅합니다. 최소 10분 동안 배양한 후 젤라틴을 제거하고 2.5 밀리리터의 2단계 배지를 추가합니다.

6웰 플레이트의 두 웰에서 형성된 배아체를 수집하여 50밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 중력에 의해 튜브 바닥에 가라앉도록 하십시오. 그런 다음 튜브에서 배지를 조심스럽게