기계적 해리를 이용한 마우스 등뿌리 신경절에서 대식세포의 격리(Isolation of Macrophages from Mouse Dorsal Root Ganglion Using Mechanical Dissociation)

후근 신경절(DRG)은 말초에서 중추 신경계로 감각 정보를 전달하는 척수를 따라 있는 신경 세포체의 클러스터입니다. 말초 신경 손상은 DRG에 대식세포 축적을 유발하고 신경병성 통증을 유발합니다.

효소가 없는 방법을 사용하여 생존 가능한 대식세포를 분리하려면 세포 스트레스를 제한하기 위해 얼음처럼 차가운 완충액으로 채워진 균질화기에 새로 해부된 마우스 DRG 조직을 채취합니다. 유봉을 사용하여 조직을 기계적으로 균질화하여 세포를 방출합니다.

세포 스트레이너를 통해 여과하여 세포 덩어리를 제거하고 플로우 스루에서 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 조직 균질에는 대식세포와 뉴런의 절연 외피인 자유 부유 미엘린을 포함하는 뉴런과 비뉴런 세포가 포함되어 있습니다.

여과된 균질을 밀도 구배 배지가 들어 있는 튜브에 넣고 원심분리합니다. 원심력에 의해 부력 밀도가 높은 생존 세포는 튜브 바닥에 침전되어 펠릿을 형성하고 미엘린은 부유 상태로 유지됩니다. 상청액을 버리십시오.

대식세포 특이적 세포 표면 수용체에 대한 형광단 접합 항체가 포함된 완충액에 세포를 재현탁합니다. 필요한 시간 동안 배양합니다. 항체는 대식세포 세포의 수용체에 결합하여 세포 표면을 형광으로 표지합니다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척하십시오.

유세포 분석기를 사용하여 세포를 분석합니다. 항체 특이적 형광 신호는 샘플에 대식세포가 존재함을 나타냅니다.

실험을 시작하기 전에 9부피의 배지와 1부피의 칼슘 및 마그네슘이 없는 10X HBSS를 혼합하여 밀도 구배 배지의 작업 용액을 준비하고 얼음 위에 보관합니다. 뒷발 꼬집기에 대한 반응 부족으로 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다.

취된 마우스를 테이프로 고정한 네 개의 발을 누운 자세로 화학 연기 후드 안에 놓는 것부터 시작합니다. 겸자를 사용하여 흉곽 아래의 피부를 들어 올린 다음 수술용 가위로 작은 절개를 하여 간과 횡격막을 노출시킵니다. 같은 가위를 사용하여 횡격막과 흉곽을 자른 다음 흉막강을 열어 뛰는 심장을 노출시킵니다.

다음으로 홍채 가위로 오른쪽 심방이를 빠르게 자릅니다. 출혈이 확인되면 좌심실 후단에 30게이지 바늘을 삽입하고 미리 냉각된 1X PBS 10밀리리터를 천천히 주입하여 동물을 관류시킵니다.

등쪽 추궁 절제술을 수행하려면 마우스를 엎드린 자세로 놓습니다. 크기 11 메스를 사용하여 흉부 부위에서 천골 부위까지 두 개의 세로 측면 깊은 절개를 합니다. 그런 다음 등쪽 근육층이 노출된 피부를 제거합니다. 그런 다음 Friedman-Pearson Rongeur를 사용하여 요천추 돌기와 양측 횡돌기가 노출될 때까지 결합 조직과 근육을 벗겨냅니다.

먼저 Friedman-Pearson Rongeur를 사용하여 척추 등쪽을 조심스럽게 엽니다. 그런 다음 Friedman-Pearson Rongeur와 Noyes Spring 가위 사이를 전환하여 척추 뼈를 제거하고 온전한 척수 신경이 부착된 척수를 노출시킵니다. 동측 및 반대측 요추 DRG를 조심스럽게 해부합니다.

얼음처럼 차가운 칼슘과 마그네슘이 없는 1X HBSS 1밀리리터에 Dounce 티슈 균질화기에 넣습니다. 느슨한 유봉으로 Dounce 균질화기에서 DRG 조직을 20-25회 균질화합니다. 멸균 70마이크로미터 나일론 세포 스트레이너를 멸균 50밀리리터 원추형 튜브에 넣습니다. 800마이크로리터의 얼음처럼 차가운 1X HBSS를 사용하여 셀 스트레이너를 적십니다.

피펫을 사용하여 균질화기에서 습식 세포 여과기로 균질화된 조직 현탁액을 수집하고 50밀리리터 원뿔형 튜브에 수집합니다. 800마이크로리터의 얼음처럼 차가운 1X HBSS로 균질화기를 두 번 헹구고 액체를 동일한 50밀리리터 원추형 튜브에 모아 수율을 높입니다.

1.5밀리리터의 평형화된 얼음 차가운 등장성 밀도 구배 배지를 멸균 5밀리리터 폴리스티렌 FACS 튜브에 첨가합니다. 세포 균질액을 50밀리리터 원추형 튜브에서 이 FACS 튜브로 옮기고 피펫을 위아래로 움직여 잘 혼합합니다.

을 밀봉하기 위해 500마이크로리터의 1X HBSS를 추가하십시오. 세포를 섭씨 4도에서 20분 동안 800배 g으로 원심분리합니다. 튜브 바닥의 세포 펠릿을 방해하지 않고 배지에 미엘린을 함유한 상청액을 조심스럽게 흡인합니다.

5% 소 태아 혈청을 함유한 PBS 100마이크로리터를 펠릿에 첨가하고 DRG 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 알파 마우스 CX3CR1-APC 항체를 세포에 첨가하고 섭씨 4도의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다.

5밀리리터의 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 세포를 섭씨 4도에서 8분 동안 360배 g으로 원심분리합니다. 상청액을 흡인한 다음 FACS 분석을 위해 세포 펠릿을 300마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다.