Isolation of Lymphocytes from a Mouse Peyer's Patch

소장벽에 조직화된 림프 조직의 응집체인 파이어 패치인 PP에는 B 림프구, T 림프구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함한 면역 세포가 포함되어 있습니다.

마우스 PP에서 림프구를 분리하려면 안락사된 마우스로 시작하십시오. 복벽을 절개하여 복막강을 노출시킵니다. 맹장을 찾으십시오. 회맹부 접합부를 해부하여 맹장을 소장에서 분리합니다.

장간막을 절제하고 십이지장에서 소장을 절개하여 복막강에서 소장을 제거합니다. 소장을 식힌 배지가 들어 있는 멀티웰 플레이트에 넣고 헹구어 잔해물을 제거합니다.

장간막이 아래를 향하도록 소장을 배치하고 조직 수분을 유지하기 위해 배지로 적십니다. PP(장벽의 항장간막 쪽에 있는 흰색 다소엽 응집체)를 식별합니다.

주변 장 조직을 제외하고 PP를 조심스럽게 절제합니다. 배지가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 지속적인 교반 하에 배양합니다. 이 교반 단계는 PP에서 점액, 세포 파편 및 대변을 분리하여 PP 림프구의 회복을 향상시킵니다.

다음으로, 조직을 적절한 메쉬 크기의 세포 여과기로 옮깁니다. PP를 부드럽게 파괴하고 세포를 방출합니다. 단일 세포 림프구 현탁액을 얻기 위해 스트레이너를 통해 배지로 플러시합니다. 세포 안정성을 유지하기 위해 현탁액을 저온에서 원심분리합니다.

림프구를 배지에 재현탁하고 추가 분석에 사용합니다.

마우스를 바로 누운 자세로 놓고 70% 에탄올로 복부를 멸균하는 것으로 시작합니다. 치골에서 흉곽까지 피부와 복막을 통해 정중선 복부 절개를 하여 복강을 열고 맹장과 회맹 접합부를 찾습니다.

장과 맹장을 분리하기 위해 접합부에서 가능한 한 원위부로 절단하고 장간막을 가위로 잘라 유문 괄약근까지 소장 전체를 조심스럽게 제거합니다.

유문과 십이지장 사이의 접합부를 잘라내어 복강에서 소장을 완전히 분리하고 분리된 소장을 차가운 RPMI 배지가 들어 있는 6웰 플레이트의 한 웰에 넣고 10% 태아 소 혈청 또는 얼음 위의 FBS를 보충합니다. 그런 다음 모든 세그먼트가 차가운 매체에 잠길 때까지 조직을 수동으로 부드럽게 교반합니다.

모든 장을 채취하면 집게를 사용하여 장 한쪽 가장자리의 장간막 지방을 잡고 샘플을 장간막면이 아래로 향하게 하여 종이 타월 위에 놓습니다. 조직 탈수 및 끈적임을 방지하기 위해 RPMI와 10% FBS로 전체 장 분절을 적시고 장벽의 항장간막 쪽에 콜리플라워 모양의 흰색 다소엽 응집체로 나타나는 파이어 패치를 찾습니다.

파이어 패치를 채취하려면 곡선이 위를 향하도록 구부러진 수술용 가위를 사용하여 주변 장 조직을 배제하도록 주의하면서 원위 및 근위 경계에서 각 패치를 부드럽게 절제하고 파이어 패치를 얼음처럼 차가운 RPMI와 10% FBS가 포함된 12웰 플레이트의 개별 웰에 넣습니다.

모든 패치가 획득되면 가위를 사용하여 직경이 개별 파이어 패치를 흡인할 수 있을 만큼 충분히 커도록 1밀리리터 마이크로피펫 팁의 끝을 자르고 파이어 패치를 섭씨 37도 RPMI와 10% FBS의 25밀리리터를 포함하는 마우스당 150밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 튜브를 섭씨 37도의 궤도 셰이커에 넣고 125-150RPM에서 10분 동안 계속 교반합니다. 교반이 끝나면 Peyer's 패치를 마우스당 140마이크로미터 세포 스트레이너에 옮기고 동물당 110밀리리터 주사기 플런저의 고무 끝을 사용하여 메쉬를 통해 개별 50밀리리터 원뿔형 튜브로 Peyer's 패치를 부드럽게 파괴합니다.

15-20밀리리터의 저온 RPMI와 10% FBS로 스트레이너를 헹구고 원심분리로 세포를 수집합니다. 상청액을 조심스럽게 버린 후, RPMI 밀리리터당 약 1 x 10⁷ 세포와 10% FBS 농도로 세포를 재현탁하여 계수합니다. 그런 다음 200마이크로리터 배지당 2 내지 2.5 x 10⁶ 세포를 96웰 원형 바닥판의 각 웰로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 펠릿화합니다.