In vitro Generation of Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors(일반 림프구 전구 세포에서 Plasmacytoid 수지상 세포의 체외 생성)

형질세포양 수지상 세포(pDC)는 사이토카인 I형 인터페론을 생성하여 감염에 반응하는 면역 세포입니다.

시험관 내에서 pDC를 생성하려면 마우스 골수에서 분리된 일반적인 림프 전구 세포(CLP)의 현탁액을 섭취합니다. CLP는 림프구와 수지상 세포로 분화할 수 있습니다.

증식을 억제하기 위해 감마선으로 조사된 피더 세포(부착 간질 세포) 층 위에 세포 현탁액을 추가합니다. 피더 세포는 CLP의 분화에 필요한 사이토카인과 세포-세포 접촉을 제공합니다.

적절한 농도의 Fms 유사 티로신 키나아제 3 리간드 또는 FL(pDC 발달을 촉진하는 2가 사이토카인)을 추가하고 배양합니다.

CLP는 피더 세포 사이를 이동하고 증식하여 조약돌 영역이라고 하는 세포 그룹을 형성합니다.

배지의 FL은 CLP의 Flt3 수용체(티로신 키나아제 수용체)에 결합합니다. 결합은 수용체 이량체화와 세포질 도메인에서 티로신 잔기의 자가인산화를 유도합니다.

세포질 어댑터 단백질은 이러한 잔기에 결합하여 인산화되어 신호를 다운스트림 신호 전달 구성 요소로 전달합니다. 신호 전달 캐스케이드는 CLP를 현탁액에서 자라는 작은 원형 세포인 pDC와 더 큰 방추 모양의 부착 세포인 기존 수지상 세포(cDC)로 분화시킵니다.

세포를 수집합니다. pDC 및 cDC 특이적 표면 마커에 대한 항체를 추가합니다. 유세포 분석을 사용하여 세포를 분석합니다.

pDC 특이적 마커에 대해 양성이고 cDC 특이적 마커에 대해 음성인 세포는 성공적인 pDC 발달을 나타냅니다.

유세포 분석법에 의해 일반적인 림프성 전구 세포 또는 CLP를 분석하기 위해, 다음으로, F_c는 항-CD16/32로 세포를 1 내지 2분 동안 차단한 후 적절한 항체 칵테일로 세포를 동시에 염색합니다.

얼음 위에서 15분 후, 3밀리리터의 FACS 완충액으로 세포를 세척하고 펠릿을 300마이크로리터의 신선한 FACS 완충액에 재현탁합니다. 그런 다음 40마이크로미터 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하고 적절한 필터와 전압을 사용하여 유세포 분석기에서 세포를 즉시 분류하여 8밀리리터의 완전 RPMI가 들어 있는 15밀리리터 튜브에 관심 세포를 수집합니다.

고농축 pDC 집단을 생성하려면 AC-6 피더 시스템을 사용한 시험관 내 배양을 위해 수확된 골수 세포에서 올바른 CLP 집단을 분류하는 것이 중요합니다.

분류가 끝나면 세포를 회전시키고 밀리리터당 약 5배 10에서 4번째 세포의 세포 밀도를 얻기 위해 충분한 완전한 RPMI로 CLP 세포 펠릿을 재현탁합니다. 다음으로, AC-6 피더 세포를 포함하는 12웰 플레이트에 웰당 500개의 세포를 시드하고 밀리리터당 100나노그램의 FLT3 리간드로 공동 배양을 보충합니다. 그런 다음 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 배양하고 현미경으로 수지상 세포 또는 DC 발달을 주기적으로 육안으로 모니터링합니다.

12일째에 공동 배양 상청액에서 세포를 수확하고 완전한 RPMI 배지 반 밀리리터로 각 웰을 한 번 세척하여 생성된 상청액을 풀링하고 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 신선한 배지 반 밀리리터를 추가하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 부착 세포를 분리합니다. 분리된 세포를 부유 세포와 결합하고 생성된 세포 현탁액을 원심분리하여 펠릿을 50마이크로리터의 FACS 완충액에 재현탁합니다.

그런 다음 방금 시연한 바와 같이 세포를 계수하고 F_c 차단 후 CD11c, CD11b 및 B220 발현에 대해 염색합니다. 그런 다음 공동 배양된 세포를 기존의 CD11c 양성, CD11b 양성, B220 음성 및 형질세포양 CD11c 양성, CD11b 음성, B220 양성 DC 집단의 존재에 대해 분석할 수 있습니다.