JoVE 실험 백과사전
면역학
0 조회수 • 3:01 분 • July 8th, 2025
세포 표면 수용체에 따라 인간 순환 B 세포는 CD19 양성 나이브 B 세포, CD19 및 CD27 양성 기억 B 세포, CD19, CD27 및 CD38 양성 형질모세포 형질 세포로 분류됩니다.
이러한 세포 집단을 분류하려면 정제된 B 세포 현탁액을 섭취하십시오. 인간 면역글로불린 G 항체와 함께 배양합니다. 항체는 B 세포의 Fc 수용체를 차단하여 비특이적 항체 결합을 방지합니다.
CD19, CD27 및 CD38을 표적으로 하는 형광 표지 항체를 추가합니다.
항-CD19 항체는 B 세포에서 유비쿼터스하게 발현되는 CD19 수용체에 결합합니다.
항-CD27 항체는 기억 B 세포 및 형질모세포 형질 세포에서 발현되는 CD27 수용체에 결합합니다.
항-CD38 항체는 형질모세포 형질 세포에서 발현되는 CD38 수용체에 결합합니다.
형광 DNA 결합 염료를 사세포 마커로 추가합니다.
죽은 세포는 막 무결성의 손실을 나타내며, 염료의 세포 유입을 허용하고 이중 가닥 DNA에 결합할 수 있습니다. 살아있는 세포는 염색되지 않은 상태로 남아 있습니다.
원심분리하여 결합되지 않은 항체와 염료를 제거하고 세포를 FACS 완충액에 재현탁합니다. 스트레이너를 통해 세포를 여과하여 균질한 현탁액을 얻고 덩어리를 제거합니다.
유세포 분석기를 사용하여 죽은 세포와 살아있는 세포를 분류합니다. 살아있는 세포 내에서 CD19, CD27 및 CD38 발현은 나이브 B 세포, 기억 B 세포 및 형질모세포 형질 세포를 구별합니다.
비특이적 차단을 수행한 후, 1 x 106 세포당 각 선택 항체 1마이크로그램을 튜브에 첨가하여 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 배양의 마지막 5분 동안 5마이크로리터의 7-AAD를 세포에 추가합니다. 그런 다음 세포에 신선한 PBS 2밀리리터를 첨가하고 원심분리하기 전에 소용돌이치
게 합니다.펠릿을 밀리리터당 1 내지 5 x 107 세포 농도로 신선한 분류 완충액에 재현탁하고 40미크론 세포 스트레이너를 통해 세포를 새로운 5밀리리터 폴리스티렌 튜브로 여과합니다. 그런 다음 유세포 분석을 통해 세포를 5밀리리터의 신선한 RPMI 배지가 들어 있는 3개의 15밀리리터 튜브로 분류하여 나이브 B 세포, 기억 B 세포 및 형질모세포 형질 세포를 수집합니다.