ELISpot Assay를 사용한 항체 분비 B 세포의 기능 평가

항체 분비 B 세포(ASC)는 병원체로부터 보호하기 위해 IgG 및 IgM을 포함한 항체 이소형을 분비하는 분화된 B 세포입니다.

시험관 내에서 ASC의 기능적 평가를 수행하려면 효소 결합 면역흡착 스팟 분석으로 시작합니다. 베이스에 활성화된 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인이 포함된 ELISpot 플레이트를 가져 가십시오.

항체의 Fc 영역 없이 Fab 영역만 포함하는 다클론 항체 단편과 함께 웰을 배양합니다. 각 Fab 영역에는 특정 항체 이소형(IgG 또는 IgM)에 대한 결합 부위가 있어 두 이소형을 모두 식별할 수 있습니다.

배양하는 동안 항체 단편이 멤브레인에 부착되어 고정됩니다.

비특이적 결합을 방지하기 위해 차단 용액으로 웰을 오버레이합니다. 활성화된 항체 분비 B 세포로 플레이트를 시드하고 배양합니다. ASC는 막 결합 항체 단편에 결합하는 IgG 및 IgM을 포함한 다양한 이소형을 분비합니다.

결합되지 않은 분비 항체를 제거하기 위해 완충액으로 플레이트를 세척합니다. 일부 웰은 IgM에 대한 효소 접합 검출 항체로, 다른 웰은 IgG에 대한 검출 항체로 처리하고 배양합니다.

검출 항체는 각각의 이소형에 결합하여 면역복합체를 형성합니다.

효소와 상호 작용하여 멤브레인에 보라색 반점을 생성하는 모든 웰에 비색 기질을 추가합니다. 중단 용액을 추가하여 반응을 중지합니다.

각 웰에서 생성된 유색 반점은 B 세포의 분비 활성과 상관관계가 있는 특정 항체의 이소형의 존재를 나타냅니다.

모든 세포가 수확되면, 신선한 RPMI 배지에서 밀리리터당 1 내지 10 x 10⁵ 세포 농도로 12웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰에 서브셋을 파종합니다. 다음으로, 세포 배양 인큐베이터에서 5일 동안 웰당 1 x 10 6 세포당 6 세포당 5마이크로그램의 CpG(ODN 2006)로 B 세포를 활성화합니다.

활성화가 끝나면 증류수에 35% 에탄올 30마이크로리터를 ELISpot 플레이트의 각 웰에 30초 동안 첨가합니다. 그런 다음 각 웰의 에탄올을 150마이크로리터의 고압멸균 이중 증류수로 교체하고 플레이트를 실온에서 5분 동안 배양하여 잔류 에탄올을 제거합니다. PBS 세척을 수행한 후 각 웰에 50마이크로리터의 항인간 Ig의 다클론 F(ab')2 단편을 추가합니다.

방금 시연한 대로 PBS로 플레이트를 두 번 세척합니다. 실온에서 2시간 동안 BSA가 포함된 200마이크로리터의 신선한 PBS로 각 웰의 비특이적 결합을 차단합니다. 또 다른 PBS 세척 시리즈 후, 섭씨 37도에서 100마이크로리터의 신선한 RPMI 1640 배지에서 웰을 배양합니다. 그런 다음 각 ELISpot 웰의 배지를 적절한 수의 활성화된 B 세포로 교체합니다.

신선한 RPMI 배지를 사용하여 각 웰의 최종 부피를 150마이크로리터로 가져옵니다. 그런 다음 ELISpot 플레이트를 8-14시간 동안 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 배양 기간이 끝나면 배지를 버리고 200마이크로리터의 PBS와 트윈 20으로 웰을 세척하여 3분 동안 5회 세척합니다.

마지막 세척 후, 적절한 검출 항체를 해당 웰에 추가하고 플레이트를 어두운 곳에서 2시간 동안 배양합니다. 또 다른 PBS 세척 시리즈 후, 실온에서 5-15분 동안 각 웰에 50마이크로리터의 BCIP/NBT 기질을 첨가합니다.

보라색 반점이 나타나면 우물당 100마이크로리터의 이중 증류수로 반응을 멈추고 흐르는 수돗물로 플레이트를 헹굽니다. 그런 다음 빛으로부터 보호된 ELISpot 멤브레인을 자연 건조시킵니다.