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면역학
0 조회수 • 5:07 분 • July 8th, 2025
거핵구는 혈액 응고에 필수적인 혈소판을 생성하는 큰 다핵 세포입니다.
시험관 내에서 혈소판을 생산하려면 인간 제대혈에서 추출한 조혈모세포 및 전구세포(HSPC)의 현탁 배양을 취하십시오.
트롬보포이에틴을 첨가하고 생리학적 조건에서 배양합니다. 트롬보포이에틴은 HSPC의 수용체에 결합하여 HSPC를 미성숙 거핵구로 분화시키는 신호 전달 이벤트를 유발합니다.
미성숙 세포는 성숙 과정을 거쳐 성숙한 거핵구를 형성합니다. 성숙한 세포는 크고 세포질 분비 과립을 포함합니다. 그들은 세포질에 다엽 배수체 핵과 함입된 막 시스템을 가지고 있습니다.
성숙한 거핵구는 길고 얇은 세포질 확장, 즉 전혈소판을 생성합니다. 얇은 세포질 다리로 연결된 여러 혈소판 크기의 부종인 전혈소판은 배지로 방출됩니다.
세포질 다리가 끊어져 개별 혈소판이 방출됩니다. 원심분리하여 혈소판을 펠릿으로 얻습니다. 상청액을 버리고 혈소판 활성화를 위한 아데노신 이인산염과 형광 표지 항체가 포함된 완충액에 펠릿을 재현탁하여 활성화된 혈소판을 식별합니다.
아데노신 이인산염은 혈소판의 특정 G-단백질 결합 수용체에 결합합니다. 결합은 신호 전달 캐스케이드를 시작하여 혈소판 활성화를 유도합니다. 활성화는 혈소판막의 인테그린 복합체를 활성화하는 세포내 신호 전달을 유도합니다. 형광 표지 항체는 활성화된 복합체에 결합합니다.
유세포 분석을 사용하여 세포를 분석합니다. 항체 특이적 형광 신호의 존재는 활성화된 혈소판을 나타냅니다.
거핵구 분화를 위해, 12웰 플레이트에 웰당 재조합 인간 트롬보포이에틴을 보충한 무혈청 배지 2밀리리터에 밀리리터당 5 x 10 5 CD34 양성 세포를 시드하여 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 배양합니다.
적절한 분화 모니터링 시점에서, 다른 웰의 세포를 방해하지 않고 시점당 2-3개의 웰에서 세포를 수확하고, 수집된 세포를 항-CD41 및 항-CD42a 항체로 염색하여 배양 내 성숙한 거핵구의 백분율을 결정합니다.
세포 표면 마커의 현미경 시각화를 위해 수확된 세포를 1밀리리터의 분리 완충액으로 세척하고 펠릿을 100마이크로리터의 신선한 완충액에 재현탁합니다. 사이토스핀을 사용하여 세포를 유리 슬라이드에 시드하고 메탄올에 30초 동안 담근 상태에서 세포를 슬라이드에 고정합니다. 공기 건조 후 20마이크로리터의 DAPI 보충 마운팅 배지로 세포를 라벨링하고 형광 현미경으로 시각화할 수 있도록 세포를 커버슬립으로 덮습니다.
전혈소판을
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