유세포 분석법을 통한 인간 사이토카인 유도 킬러 세포의 CD 마커 인식

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면역학

0 조회수 • 5:35 분 • July 8th, 2025

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사이토카인 유도 킬러(CIK) 세포는 특정 사이토카인 및 단클론 항체로 자극된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 배양에서 생체 외에서 생성된 이종 면역 세포 집단입니다. CIK 세포는 CD3+CD56+ NK-T 세포, CD3+CD56- T 세포 및 CD3-CD56+ NK 세포를 포함하는 세포 집단을 포함한다.

CIK 세포 비율을 결정하려면 PBMC 유래 CIK 세포 현탁액이 포함된 튜브로 시작합니다. 서로 다른 형광단에 접합된 항-CD3 및 항-CD56 항체 및 이들의 혼합물을 지정된 튜브에 추가합니다. 유사한 형광단에 특이적 항체로 접합된 이소형 대조 항체를 다른 튜브에 추가합니다.

형광 표지된 항-CD3 및 항-CD56 항체는 각각 CIK 세포 집단에서 발현되는 CD3 및 CD56을 인식하고 결합합니다. 이소형 대조 항체는 표적 항원 특이성이 부족하여 비특이적 배경 신호 측정을 용이하게 합니다.

세포 응집체를

제거하는 데 도움이 되는 세포 스트레이너 캡이 있는 둥근 바닥 튜브에 세포를 피펫팅합니다. 튜브를 유세포 분석기 캐러셀에 로드합니다. 실행 중에 각 셀은 채널을 통과하고 레이저 빔을 만나 빛을 산란시킵니다.

한 검출기는 셀 크기를 나타내는 전방 산란광도를 측정합니다. 다른 하나는 레이저 빔에 수직인 측면 산란광도를 측정하여 세포 입도를 암시합니다. 이 정보는 함께 면역 세포 집단을 식별하는 데 도움이 됩니다.

동시에, 특정 여기 파장의 레이저 빔은 세포의 형광단 접합 항체를 여기시켜 형광 신호 방출을 유발하여 감지됩니다.

세포의 특정 형광 강도를 분석하면 CIK 세포 하위 집단의 비율이 결정됩니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 CIK 세포의 준비로 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 CIK 세포를 멸균 PBS 10밀리리터로 세척합니다. 300배g, 섭씨 18-20도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 5밀리리터의 PBS로 세포를 재현탁합니다. 세포 수를 계산하고 트리판 블루 배제 분석을 사용하여 세포 생존력을 테스트합니다.

CIK 세포를 PBS 밀리리터당 약 0.5 내지 100만 개의 세포 밀도로 6개의 멸균 1.5밀리리터 튜브에 분취합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 세포에 레이블을 지정하고 처리합니다. 1밀리리터 멸균 피펫으로 최소 3회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 CIK 세포를 항체와 부드럽게 혼합합니다. 어둠 속에서 실온에서 15분 동안 세포를 배양합니다.

튜브를 300배 g 및 섭씨 18-20도에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 1밀리리터의 PBS로 재현탁합니다. 그런 다음 1밀리리터 멸균 피펫을 사용하여 세포를 위아래로 부드럽게 세 번 부드럽게 피펫팅합니다. 캡을 통해 부드럽게 피펫팅하여 세포 현탁액을 세포 스트레이너 캡이 있는 멸균 5밀리리터 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 회전목마에 순서대로 놓습니다.

유세포 분석 소프트웨어를 열고 실험 폴더를 만듭니다. 그런 다음 "새 표본" 버튼을 클릭하여 실험에 표본과 튜브를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 튜브의 이름을 지정합니다.

CIK 세포 집단에 대한 산란 게이팅 시스템을 생성하려면 먼저 튜브 1을 선택하고 도트 플롯 버튼을 클릭하여 FSC-A/SSC-A 플롯을 생성합니다. 세포 파편을 배제하기 위해 FSC-A 임계값이 5,000보다 큰 전체 세포 집단에 직사각형 게이트를 그립니다.

새 도트 플롯에 대한 FSC-A/FSC-H 매개변수를 선택하고 모든 단일 셀 주위에 다각형 게이트를 그립니다. 새 히스토그램 플롯에 대해 count 대 FITC 접합(CD3) 및 count 대 APC 접합(CD56) 매개변수를 선택합니다. 새 도트 플롯에 대해 FITC 공액(CD3) 대 APC 공액(CD56) 매개변수를 선택하고 4사분면 게이트를 그려 4개의 하위 모집단을 정의합니다.

각 표본에 20,000개의 단일 세포의 데이터를 기록합니다. "Load Sample" 버튼을 클릭하여 빈 대조군 샘플을 먼저 분석합니다. CD56 및 CD3 채널 매개변수를 사용하여 전체 CIK 세포 집단을 식별합니다. CIK 세포 집단을 분석하기 위해 개별 표본의 통계 값이 포함된 파일을 열고 분석 파일로 다시 인쇄합니다.

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마지막 업데이트: 22 8월 2026