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림프구 T 세포와 자연 살해 세포 또는 NK 세포에서 분비되는 사이토카인인 인터페론-감마 또는 IFN-γ는 병원체에 대한 면역 반응을 매개합니다.
제자리 IFN-γ 생산을 연구하기 위해, 모델 항원인 오브알부민을 인식하는 수용체를 발현하도록 조작된 형광 표지 T 세포를 이식한 마우스를 취하십시오.
오브알부민을 발현하도록 유전자 변형된 병원성 박테리아의 현탁액을 쥐에게 정맥 주사하여 전신 감염을 일으킵니다. 순환하는 박테리아는 이차 림프 기관인 비장에 도달하여 면역 세포와의 상호 작용을 촉진하여 병원체 제거를 돕습니다.
항원 제시 세포는 박테리아를 삼키고 항원을 표시합니다. T 세포는 수용체를 통해 항원에 결합하고 활성화되며 IFN-γ을 생성합니다.
박테리아에 감염된 대식세포 세포는 면역 매개체를 방출하고 표면의 활성화 리간드를 상향 조절합니다. 이러한 신호와 상호 작용하면 NK 세포가 활성화되어 IFN-γ을 생성합니다.
세포내 단백질 수송 억제제를 주입하여 IFN-γ 분비를 제한하여 세포내 축적을 유발합니다.
쥐 비장을 수확하십시오. 조직을 고정하고 절편을 돕기 위해 얼립니다. 냉동 마이크로톰을 사용하여 얇은 조직 절편을 생성하고 유리 슬라이드 위에 놓습니다. 표면 마커에 결합하는 NK 세포 특이적 항체와 세포내 IFN-γ를 염색하는 IFN-γ 특이적 항체를 추가합니다. 이러한 항체는 서로 다른 형광단으로 표지됩니다.
슬라이드를 형광 현미경 아래에 놓아 NK 세포와 T 세포 내부의 IFN-γ를 검출합니다.
고정액을 버리고 실온에서 5분 동안 5밀리리터의 PBS를 부드럽게 교반합니다. 그런 다음 PBS를 5밀리리터의 30% 자당으로 교체하고 조직 형태를 유지하기 위해 12-24시간 동안 배양합니다. 이제 오르간은 접시 바닥에 가라앉습니다.
샘플을 얼리려면 큰 용기에 드라이아이스를 넣고 그 안에 약 50밀리리터의 순수 메탄올과 몇 조각의 드라이아이스가 들어 있는 작은 용기를 넣습니다. 보푸라기가 없는 물티슈로 비장을 부드럽게 말리십시오. 베이스 몰드 바닥에 OCT 화합물 한 방울을 떨어뜨리고 비장을 몰드 안에 넣습니다. 기포가 생기지 않도록 주의하세요.
비장 위에 약 1밀리리터의 OCT를 추가합니다. 집게를 사용하여 메탄올이 OCT에 닿지 않도록 드라이아이스 수조의 메탄올 표면에 베이스 몰드를 증식시킵니다. OCT는 얼면 두꺼워지고 하얗게 변합니다. 아티팩트를 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 조직을 얼리는 것을 잊지 마십시오.
극저온 마이크로톰에서 섭씨 영하 21도의 온도로 설정합니다. 조직을 원하는 두께로 약 10마이크로미터로 절편합니다. 브러시를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에 절편을 수집하고 육안으로 검사합니다. 섹션이 실온에 도달하도록 하십시오.
OCT 외부의 조직 섹션 주위에 PAP 펜과 같은 액체 차단제로 원을 그립니다. 조직이 건조되면 조직 절편에 100마이크로리터의 PBS를 5분 동안 떨어뜨려 샘플을 재수화합니다. 그런 다음 흡인을 통해 절편에서 PBS를 제거하고 샘플 절편당 100마이크로리터의 차단 용액을 추가합니다. 뚜껑이 있는 습식 챔버에서 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다.
1차 항체로 염색하려면 차단 용액을 각 샘플에 대해 준비된 1차 항체 혼합물로 교체하십시오. 원고에 따라 세척하기 전에 실온에서 4시간 동안 또는 뚜껑이 있는 젖은 챔버에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.
이제 관심 있는 2차 항체를 차단 용액에서 밀리리터당 일반적으로 2.5마이크로그램의 최적 농도로 희석합니다. 절편에서 최종 세척액을 제거하고 준비된 2차 항체 혼합물을 절편 위에 첨가하고 뚜껑이 있는 습식 챔버에서 실온에서 1-4시간 동안 배양합니다.
원고에 따라 세척 완충액으로 세척한 후 세척액을 제거하고 PBS로 최종 세척을 수행합니다. 인산염 완충 식염수를 흡인하고 절편이 완전히 건조되지 않고 나머지 PBS가 증발하도록 합니다.
슬라이드 뒷면의 섹션 주위에 원을 그립니다. 그런 다음 샘플 위에 마운팅 매체 한 방울을 놓고 매체가 전체 섹션을 덮도록 한 다음 그 위에 커버 유리를 조심스럽게 놓습니다. 샘플을 어둠 속에서 실온에서 밤새 중합시키십시오.
아침에 슬라이드를 거꾸로 된 스펙트럼 레이저 스캐닝 현미경 아래에 놓습니다. 사이토카인 세포하 국소화 분석을 위해 대물렌즈를 10x/NA 0.40 또는 60x/NA 1.4로 조정합니다.