Murine Whole Blood에서 혈소판의 정화 및 활성화

혈관 손상 후 혈소판은 손상 부위에서 모집 및 활성화되어 혈소판 플러그를 형성하고 조직 복구를 시작합니다.

쥐 전혈에서 혈소판을 정제하고 시험관 내에서 활성화하려면 적절한 밀도 구배 배지를 섭취하십시오. 혈액 샘플을 배지 위에 조심스럽게 겹겹이 쌓습니다. 혈장과 적혈구층과 백혈구층에서 혈소판을 분리하기 위해 원심분리합니다.

혈소판을 적절한 염색 완충액이 들어 있는 두 개의 새 튜브로 옮깁니다. 글리신-프롤린-아르기닌-프롤린 아미노산 서열을 함유한 합성 GPRP 테트라펩타이드를 하나의 튜브에 첨가한 다음 트롬빈을 첨가합니다.

트롬빈은 혈소판 표면 트롬빈 수용체의 특정 세포외 도메인을 절단하여 다운스트림 신호 전달 캐스케이드를 시작하고 혈소판을 활성화합니다. 활성화된 혈소판의 과립은 CD62P 단백질을 방출하여 막 표면으로 빠르게 이동합니다.

GPRP 테트라펩타이드는 피브리노겐(활성화된 혈소판의 막을 가로지르는 인테그린 CD41/CD61에 결합하여 혈소판 응집을 시작하는 당단백질)을 차단하여 활성화된 혈소판을 현탁액으로 유지합니다.

형광 표지된 항-CD41 및 항-CD62P 항체를 혈소판 함유 튜브에 추가합니다.

항-CD41 항체는 휴식 및 활성화된 혈소판에서 유비쿼터스적으로 발현되는 CD41에 결합합니다. 그러나 항-CD62P는 활성화된 혈소판의 막 표면으로 전좌된 CD62P에 특이적으로 결합합니다.

유세포 분석을 사용하여 세포를 분석합니다. 휴식 혈소판은 CD41+ 세포로 나타나는 반면, 활성화된 혈소판은 CD41+ CD62P+ 세포로 특징지어집니다.

혈소판을 정제하려면 넓은 구경의 피펫 팁을 사용하여 200마이크로리터의 갓 채취한 전혈을 1.5밀리리터 튜브의 측면을 따라 혼합하지 않고 600마이크로리터의 이오헥솔 그래디언트 배지에 천천히 적층합니다.

혈

소판을 분리하기 위해 스윙 버킷 로터에서 원심분리한 후, 새로운 와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 혈소판이 풍부한 층의 대부분과 백혈구 또는 적혈구층을 흡인하지 않고 혈소판 부족층의 작은 부분을 수집합니다. 혈소판 샘플을 새 튜브에 추가하고 혈소판에 PBS 1밀리리터를 추가합니다.

또 다른 원심분리를 수행하기 전에 혈소판을 반전시켜 혼합합니다. 그런 다음 가벼운 피펫팅으로 펠릿을 200마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다. 혈소판 활성화를 위해 1-2 x 10을 6번째 혈소판에 100마이크로리터의 염색 완충액이 들어 있는 새 튜브로 옮깁니다. 0.4밀리몰 GPRP