인간 말초 혈액 단핵 세포에서 CD4⁺ Vδ1⁺ γδ T 세포의 선택적 분리

γδ T 세포는 가변 및 일정한 도메인을 가진 감마 및 델타 사슬로 구성된 T 세포 수용체, TCR을 발현합니다.

CD4+ Vδ1+ T 세포(γδ T 세포 하위 집단)는 가변 Vδ1 사슬과 CD4 보조 수용체를 공동 발현합니다. 이 세포는 염증이 있는 조직으로 이동하여 기능적으로 성숙한 CD4+ 또는 CD8+ αβ T 세포로 분화되어 면역 반응을 매개합니다.

인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+ Vδ1+ T 세포를 분리하려면 세포를 완충액에 재현탁합니다. Fc 차단 시약을 사용하여 세포 표면 Fc 수용체를 차단하고 비특이적 항체 결합을 방지합니다.

γδ T 세포의 Vδ1 항원에 결합하는 형광단 FITC와 접합된 항-Vδ1 항체를 추가합니다. Vδ1 T 세포 결합 항체의 FITC 염료에 부착된 항-FITC 항체 결합 자기 마이크로비드와 함께 배양합니다.

혼합물을 자기 컬럼에 통과시켜 비드에 결합된 Vδ1+ T 세포를 끌어당깁니다. Vδ1-T 세포는 결합되지 않은 상태로 남아 있으며 이후에 씻어냅니다. Vδ1+ T 세포를 분리하기 위해 버퍼를 밀어 컬럼을 강제로 세척합니다.

세포의 CD4 보조 수용체에 결합하는 항-CD4 항체 코팅 마그네틱 비드와 함께 세포를 배양합니다. 튜브를 자석에 넣어 비드에 결합된 CD4+ Vδ1+ T 세포를 끌어당깁니다. CD4-Vδ1+ T 세포는 결합되지 않은 상태로 유지됩니다.

CD4+ Vδ1+ T 세포를 배지에 재현탁합니다. 비드 분리 시약을 추가하여 세포에서 비드를 방출합니다. 자석의 튜브를 교체하여 구슬을 분리합니다.

추가 분석을 위해 CD4+ Vδ1+ 세포 상청액을 수집합니다.

Vδ1 T 세포 분리를 시작하기 전에 PBMC의 1 x 10⁶ 분취량을 사용하여 유세포 분석을 통해 기증자 샘플에서 Vδ1CD4 양성 T 세포의 빈도를 평가합니다. 그런 다음 나머지 림프구를 회전시키고 1 x 10⁷ 세포당 60마이크로리터의 MACS 완충액에 펠릿을 다시 현탁합니다.

다음으로, 1 x 10⁷ 세포당 20 마이크로리터의 Fc 차단 시약으로 세포를 차단한 다음 1 x 10⁷ 세포당 10 마이크로리터의 FITC 접합 항-인간 Vδ1 항체를 어둠 속에서 섭씨 4도에서 12분 동안 첨가합니다. 배양이 끝나면 14밀리리터의 MACS 완충액으로 세포를 세척합니다.

펠릿을 1 x 10⁷ 세포당 80마이크로리터의 MACS 완충액에 재현탁하고, 혼합하여 1 x 10⁷ 세포당 20마이크로리터의 항-FITC 마이크로비드를 첨가합니다. 섭씨 4도의 어두운 곳에서 15분 후, 10밀리리터의 신선한 MACS 완충액으로 세포를 세척합니다.

원심분리하는 동안 예냉된 마그네틱 컬럼을 500마이크로리터의 MACS 완충액으로 평형을 이룹니다. 그런 다음 세포를 500마이크로리터의 MACS 완충액에 재현탁하고 컬럼 상단에 조심스럽게 추가합니다.

3개의 500마이크로리터 MACS 완충액 세척으로 컬럼을 헹굽니다. 그런 다음 자석에서 컬럼을 제거하고 플런저를 사용하여 1밀리리터의 MACS 완충액으로 Vδ1 양성 세포를 15밀리리터 원뿔형 튜브에 빠르게 세척합니다.

두 번째 컬럼을 통해 세포를 실행한 후 25마이크로리터의 CD4 비드를 30초 동안 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 비드를 1밀리리터의 MACS 완충액이 들어 있는 1.5밀리리터 반응 튜브에 옮기고 튜브를 자석 위에 놓습니다.

1분 후, 200마이크로리터 피펫을 사용하여 상청액을 조심스럽게 흡인하고 비드를 25마이크로리터의 MACS 완충액에 재현탁합니다. 다음으로, 분리된 Vδ1 양성 세포를 스핀다운하고 펠릿을 500마이크로리터의 MACS 완충액에 재현탁합니다. 세포를 구슬과 세게 섞습니다. 그런 다음 섭씨 20도에서 4분 후 일정하게 기울인 상태에서 튜브를 자석 위에 다시 놓습니다.

샘플 부피 손실을 방지하고 오염된 CD4 음성 세포의 존재를 최소화하려면 뚜껑 내부에서 남아 있는 완충액을 바이알로 다시 피펫팅하는 것이 중요합니다.

2분 후, 200마이크로리터 피펫을 사용하여 CD4 음성 Vδ1 양성 세포 함유 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 자석에서 CD4 양성 세포를 제거하고 500마이크로리터의 MACS 완충액에 재현탁합니다.

방금 시연한 바와 같이 CD4 음성 세포를 두 번 더 제거한 후, CD4 양성 세포를 100마이크로리터의 배양 배지와 10마이크로리터의 비드 분리 용액에 실온에서 일정한 기울기로 45분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 세포를 자석에 1분 동안 되돌린 다음 200마이크로리터 피펫을 사용하여 비드가 없는 Vδ1 양성 CD4 양성 세포 함유 상청액을 새 튜브로 옮깁니다.

방금 설명한 것처럼 남은 구슬을 두 번 더 제거한 후 셀을 회전시킵니다. 그런 다음 계수를 위해 Vδ1 양성 CD4 양성 세포를 신선하고 예열된 배지에 재현탁합니다.