인간 말초 혈액 단핵 세포에서 CD4⁺ Vδ1⁺ γδ T 세포의 선택적 분리

γδ T 세포는 가변 및 일정한 도메인을 가진 감마 및 델타 사슬로 구성된 T 세포 수용체, TCR을 발현합니다.

CD4+ Vδ1+ T 세포(γδ T 세포 하위 집단)는 가변 Vδ1 사슬과 CD4 보조 수용체를 공동 발현합니다. 이 세포는 염증이 있는 조직으로 이동하여 기능적으로 성숙한 CD4+ 또는 CD8+ αβ T 세포로 분화되어 면역 반응을 매개합니다.

인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+ Vδ1+ T 세포를 분리하려면 세포를 완충액에 재현탁합니다. Fc 차단 시약을 사용하여 세포 표면 Fc 수용체를 차단하고 비특이적 항체 결합을 방지합니다.

γδ T 세포의 Vδ1 항원에 결합하는 형광단 FITC와 접합된 항-Vδ1 항체를 추가합니다. Vδ1 T 세포 결합 항체의 FITC 염료에 부착된 항-FITC 항체 결합 자기 마이크로비드와 함께 배양합니다.

혼합물을 자기 컬럼에 통과시켜 비드에 결합된 Vδ1+ T 세포를 끌어당깁니다. Vδ1-T 세포는 결합되지 않은 상태로 남아 있으며 이후에 씻어냅니다. Vδ1+ T 세포를 분리하기 위해 버퍼를 밀어 컬럼을 강제로 세척합니다.

세포의 CD4 보조 수용체에 결합하는 항-CD4 항체 코팅 마그네틱 비드와 함께 세포를 배양합니다. 튜브를 자석에 넣어 비드에 결합된 CD4+ Vδ1+ T 세포를 끌어당깁니다. CD4-Vδ1+ T 세포는 결합되지 않은 상태로 유지됩니다.

CD4+ Vδ1+ T 세포를 배지에 재현탁합니다. 비드 분리 시약을 추가하여 세포에서 비드를 방출합니다. 자석의 튜브를 교체하여 구슬을 분리합니다.

추가 분석을 위해 CD4+ Vδ1+ 세포 상청액을 수집합니다.

Vδ1 T 세포 분리를 시작하기 전에 PBMC의 1 x 10⁶ 분취량을 사용하여 유세포 분석을 통해 기증자 샘플에서 Vδ1CD4 양성 T 세포의 빈도를 평가합니다. 그런 다음 나머지 림프구를 회전시키고 1 x 10⁷ 세포당 60마이크로리터의 MACS 완충액에 펠릿을 다시 현탁합니다.

다음으로, 1 x 10⁷ 세포당 20 마이크로리터의 Fc 차단 시약으로 세포를 차단한 다음 1 x 10⁷ 세포당 10 마이크로리터의 FITC 접합 항-인간 Vδ1 항체를 어둠 속에서 섭씨 4도에서 12분 동안 첨가합니다. 배양이 끝나면 14밀리리터의 MACS 완충액으로 세포를 세척합니다.

펠릿을 1 x 10⁷ 세포당 80마이크로리터의 MACS 완충액에 재현탁하고, 혼합하여 1 x 10⁷ 세포당 20마이크로리터의