인간 호중구 세포 외 트랩을 생성하는 In vitro 기술

호중구 세포외 트랩(NET)은 병원균을 가두어 중화하는 항균 단백질과 복합된 염색질 섬유의 거미줄 모양 구조입니다. NET은 특수한 세포질 과립에 항균 단백질을 저장하는 면역 세포인 호중구에 의해 분비됩니다.

시험관 내에서 NET 형성을 연구하려면 분리된 호중구의 현탁액을 복용하십시오. 친유성 전염증성 화합물인 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)를 추가합니다. 세포를 플레이트하고 배양합니다.

PMA는 호중구막을 통과하여 세포질로 들어가 단백질 키나아제 C 또는 PKC에 결합하고 활성화합니다.

활성화된 PKC는 다운스트림 신호 전달을 유도하여 NADPH 산화효소(효소 복합체)의 세포질 성분을 인산화하여 혈질과 과립막에 조립을 일으킵니다. 복합체는 활성 산소종 또는 ROS를 생성합니다.

ROS는 과립에서 프로테아제와 항균 단백질을 방출합니다. 입상 프로테아제는 ROS 활성화 시트룰린화 효소와 함께 핵으로 이동합니다.

입상 프로테아제는 부분적인 히스톤 분해를 일으키는 반면, 시트룰린화 효소는 히스톤 시트룰린화를 촉진하여 양전하를 중화시킵니다. 이러한 변형은 히스톤-DNA 상호 작용을 방해하여 염색질 축합을 초래합니다.

핵층의 변형은 핵막 파열과 염색질 외부화를 유발합니다. 염색질은 세포질 항균 단백질과 혼합되어 NET을 형성합니다. 세포막의 투과화는 NET의 세포외 방출을 유발합니다.

바닥에 부착된 NET과 호중구를 방해하지 않고 배지를 폐기하십시오. 부착된 성분을 버퍼에 재현탁합니다.

원심분리하여 세포를 침전시켜 NET이 풍부한 상청액을 다운스트림 분석에 사용할 수 있도록 남깁니다.

호중구 세포외 트랩 또는 NET의 형성을 자극하기 위해 20mm 그리드가 있는 150mm x 25mm 평면 조직 배양 접시에서 호중구 현탁액 30ml에 500나노몰의 PMA를 추가합니다. 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 이하에서 4시간 동안 배양합니다.

배양 후 접시 바닥에 부착된 NET 및 호중구 층을 방해하지 않도록 주의하면서 배지를 부드럽게 흡인하고 버립니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 칼슘과 마그네슘이 없는 차가운 PBS 15밀리리터로 각 접시의 바닥을 씻습니다. 바닥에서 모든 접착 물질을 제거해야 합니다.

세척 현탁액을 15밀리리터 원뿔형 튜브에 모은 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 450 x g으로 원심분리합니다. 호중구와 나머지 세포는 바닥에 펠릿화되어 세포가 없는 NET 풍부한 상청액을 남깁니다.

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