쥐 치아 블록에서 치은 면역 세포 네트워크 분리

치은, 즉 잇몸 조직은 치아의 경추 부분과 턱뼈를 둘러싸

고 있습니다.

치은 조직은 콜라겐이 풍부한 기저막에 의해 기본 결합 조직과 분리된 상피층으로 구성됩니다. 치은 결합 조직에는 치은을 감염으로부터 보호하는 림프구, 비만 세포 및 호중구를 포함한 면역 세포 네트워크가 포함되어 있습니다.

치은 면역 세포 네트워크를 분리하려면 단단히 부착된 치은 조직이 포함된 쥐 치아 블록을 채취하십시오. 4형 콜라게나제와 DNase를 함유한 효소 칵테일로 블록을 처리합니다.

콜라게나제는 조직에 들어가 콜라겐-IV를 분해하고 기저막과 치은 상피를 파괴하여 치아에서 치은이 느슨해지게 합니다. 한편, DNase는 DNA 오염 물질을 분해합니다. 튜브에 킬레이트제를 첨가하십시오. 2가 양이온을 제거하고 세포 응집을 방지합니다.

소화된 치아 블록을 DNase 배지가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 치아 블록에서 치은 조직을 추출하여 세포 여과기로 옮깁니다.

플런저를 사용하여 티슈를 으깨십시오. 이러한 기계적 해리는 치은 결합층을 파괴하여 조직에서 면역 세포를 방출합니다. 여과기를 배지로 세척하고 방출된 세포를 여과액에 수집합니다.

여과액을 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 잔류 효소와 파편이 포함된 상청액을 버립니다. 면역 세포를 운반하는 세포 집단을 완전한 배지에 재현탁하여 향후 분석을 준비합니다.

치은 경계에서 과도한 조직을 제거하고 상악 및 하악 블록을 얼음 위에 5밀리리터의 콜라게나제와 DNase가 들어 있는 50밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 섭씨 37도의 셰이커 인큐베이터에서 1시간 동안 조직을 소화하고 마지막 5분 동안 50마이크로리터의 0.5몰 EDTA를 추가합니다. 그런 다음 5밀리리터의 차가운 DNase 배지를 조직에 첨가하고 소용돌이치면서 튜브 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 다음으로, 4개의 조직 블록을 페트리 접시에 옮기고 500마이크로리터의 신선한 DNase 배지로 덮습니다.

메스를 사용하여 각 조직 블록에서 치은을 제거하고 접시의 전체 내용물을 50밀리리터 튜브 위에 있는 70미크론 세포 여과기로 옮깁니다. 페트리 접시와 스트레이너를 3-5밀리리터의 신선한 DNase 배지로 세척한 다음 멸균 3밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 스트레이너의 메쉬에 대고 치은 조직을 으깨십시오. 30-35밀리리터의 차가운 DNase 배지로 스트레이너를 헹구고 여과액을 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿을 1밀리리터의 완전 배지에 재현탁하고 생존 가능한 세포의 수를 결정합니다.