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대식세포 세포외 트랩(MET)은 병원균을 가두어 제거하기 위해 대식세포에서 방출되는 거미줄 모양의 구조입니다.
MET는 매트릭스 메탈로프로테이나제-9, MMP-9 및 시트룰린화 히스톤 H3, H3Cit(아르기닌이 시트룰린으로 전환되는 변형된 히스톤 단백질)와 관련된 세포외 염색질 섬유로 구성됩니다.
포르말린 고정, 파라핀 포매 쥐 폐 조직 절편에서 MET를 특성화하려면 먼저 슬라이드를 건조시킵니다. 자일렌에 담가 절편을 탈파라핀화합니다. 수성 에탄올을 사용하여 절편을 재수화합니다.
절편을 가열하여 포르말린 유도 단백질 가교를 끊고 후속 항체 결합을 위해 표적 항원을 노출시킵니다.
단백질 함유 용액을 첨가하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 항-MMP-9, 항-H3Cit 및 항-F4/80 1차 항체의 칵테일과 함께 배양합니다.
항-F4/80 항체는 대식세포 표면 당단백질 F4/80에 결합합니다. 항-MMP-9 및 항-H3Cit 항체는 각각 MET에서 MMP-9 및 H3Cit에 결합합니다. 표적에 결합된 각각의 1차 항체에 결합하는 다양한 형광단 접합 2차 항체를 추가합니다.
DAPI 함유 마운팅 매체로 섹션을 마운팅합니다. DAPI는 MET의 염색질 섬유를 염색합니다. 공초점 현미경을 사용하여 단면을 이미지화하여 MET 마커의 형광을 시각화합니다.
MET는 세포외 염색질 섬유와 F4/80, MMP-9 및 H3Cit의 공동 발현을 특징으로 합니다.
FFPE 샘플을 항원 회수 용액으로 전처리하려면 슬라이드를 섭씨 60도에서 60분 동안 오븐 건조합니다. 그런 다음 슬라이드를 자일렌 용액에 30분 동안 옮긴 후 샘플을 실온에서 5분 동안 70% 에탄올로 옮깁니다.
수돗물을 사용하여 슬라이드를 헹구고 내열 플라스틱 랩에 넣고 Tris-EDTA pH 9.0의 압력솥에 10분 동안 넣어 더 높은 항원 회수를 실시합니다. 샘플을 20분 동안 식힌 다음 수돗물로 옮깁니다. 그런 다음 로커에 5분 동안 놓습니다. 수돗물 세척을 반복한 다음 로커의 PBS에서 슬라이드를 한 번 세척합니다.
샘플을 차단하려면 5% BSA/PBS에 10% 닭고기 혈청을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 대식세포 세포외 트랩 또는 대식세포의 MET를 정의하기 위해 1% BSA/PBS에 1차 항체의 1-100 희석액을 추가하고 슬라이드를 섭씨 4도에서 16시간 동안 배양합니다.
PBS를 사용하여 샘플을 로커에서 각각 5분 동안 두 번 세척합니다. 해당 형광 2차 항체를 1% BSA/PBS에 첨가하고 슬라이드를 실온에서 40분 동안 배양합니다. PBS 세척 후 DAPI 함유 마운팅 매체를 사용하여 염색질을 염색하고 샘플을 마운트합니다.
도립 현미경에 부착된 공초점 레이저 스캐닝 헤드를 사용하여 20X 0.1 NA 공기 및 40X 1.0 NA 오일 대물렌즈를 사용하여 형광 이미지를 캡처합니다. 단일 평면 512 x 512 픽셀 이미지를 캡처하려면 선 순차, 레벨링 버튼을 클릭합니다. 각 결과에 대한 분석 및 데이터를 위해 섹션당 최소 10개의 시야 필드를 얻습니다.