Gamma Delta 상피내 림프구의 생체 내 시각화

감마 델타 상피내 림프구(γδ IEL)는 감마 델타 T 세포 수용체를 발현하는 특수한 이동성 T 세포입니다. 이 세포는 주로 장 상피 내에서 발견되며 상피를 순찰하여 장 전체의 병원체 전위를 제한합니다.

살아있는 유기체 내에서 γδ IEL을 시각화하려면 부분적으로 노출된 소장을 가진 마취된 형질전환 마우스로 시작합니다. 형질전환 마우스는 γδ IEL에서만 리포터 단백질(향상된 녹색 형광 단백질)을 발현하도록 유전자 변형되어 추적이 가능합니다.

전기 소작을 사용하여 역장 표면을 따라 노출된 소장 위에 천공선을 만들어 과도한 출혈을 방지합니다.

천공선 위에 세로로 절개하여 장 점막을 노출시키고 여러 손가락 모양의 돌출부(융모)를 보여줍니다. 각 융모에는 장 내강으로 돌출된 γδ IEL이 상주하는 상피 세포가 포함되어 있습니다.

노출된 점막 표면이 형광 염료와 직접 접촉하는 마우스를 배치하여 내강에 적색 형광을 부여합니다.

공초점 현미경으로 마우스를 이미지화합니다. 융모 끝 상피에서 시작하여 z축을 따라 서로 다른 초점면에서 융모와 이미지를 찾습니다. 이러한 광학 섹션을 결합하여 3D 이미지를 생성합니다.

생체 내 이미징은 적색 내강 근처의 상피 세포의 기저막을 따라 녹색 형광 γδ IEL의 동적 이동을 보여줍니다.

혈관 사이의 밑에 있는 장간막의 양쪽에 두 쌍의 집게를 놓고 집게의 끝을 부드럽게 문질러 막에 구멍을 만듭니다. 각진 겸자와 5cm 봉합사에 부착된 곡선 테이퍼 포인트 바늘을 사용하여 복막의 구멍을 통해 복막의 한쪽을 관통하고 복막 내벽의 다른 쪽을 통해 위쪽으로 관통하여 절개 부위의 상단에 봉합사 하나를 배치하고 절개 부위의 하단 근처에 다른 봉합사를 배치하여 장 루프를 외부화한 상태로 절개를 봉합합니다.

성공 가능성을 높이려면 복부 구조를 배치하는 동안 혈관을 묶거나 찢지 말고 장의 외부 취급을 제한하십시오.

그런 다음 같은 방식으로 장 루프 아래의 피부를 닫고 밑에 있는 복막의 이전 봉합사 사이의 절개 중간에 하나의 봉합사를 배치합니다. 전기 소작을 사용하여 항장간막 경계를 따라 천공선을 만들고 즉시 장 표면에 물 몇 방울을 떨어뜨려 추가적인 열로 인한 조직 손상을 방지합니다.

킴와이프로 닦아내어 잔여 물을 제거합니다. Vannas 가위를 사용하여 소작 조직의 원위 가장자리에서 소작 라인의 길이를 따라 외부화된 조직 세그먼트의 근위 끝을 향해 약 1.5cm 수평 슬릿을 자릅니다. 점막 표면이 노출되면 촉촉한 킴와이프로 복부를 덮어 조직의 수분을 유지합니다.

스피닝 디스크 공초점 현미경 이미징의 경우 마우스를 덮은 용기에 있는 현미경으로 운반합니다. 이미징 소프트웨어를 실행하고 현미경 헤드를 뒤로 기울인 다음 Hank의 완충 식염수에 150마이크로리터의 1마이크로몰 플릿 AlexaFluor 염료를 유리 커버슬립 바닥에 추가합니다. 열린 점막 표면이 커버슬립에 직접 닿도록 마우스를 배치합니다.

마우스와 접시를 미리 예열된 인큐베이터의 이미징 스테이지에 놓습니다. 각 레이저의 여기 강도와 노출 시간을 각각 10-15밀리와트, 120-150밀리초 이하로 설정하고 프레임 평균을 "2"로 조정합니다.

전자 증식 이득 기능을 켜서 배경 노이즈를 줄이고 63X 객관적 보정을 선택하여 픽셀 크기를 정확하게 측정합니다. 405나노미터 레이저와 20배 공기 대물렌즈를 사용하여 핵을 수동으로 시각화하여 눈에 띄는 움직임이나 드리프트가 없는 융모 영역을 찾아 호흡, 연동 운동 또는 심장 박동으로 인한 인공적인 움직임 영역을 피합니다.

XY 스캔을 사용하여 관심 필드의 x-y 좌표를 기록하고 글리세롤 침지 63X 대물렌즈로 전환합니다. 최대 1분 동안 405나노미터 채널에서 라이브 이미지를 획득하여 선택한 필드의 융모가 안정적인지 확인하는 동시에 초점을 조정하여 융모 끝 바로 아래에 있는 직교 평면을 찾습니다.

그런 다음 융모 끝 상피 바로 아래에서 시작하여 약 15 내지 20 마이크로미터에서 시작하여 융모까지 1.5 마이크로미터 단계를 사용하여 핵을 분해하기 어려울 때까지 Z-스택을 획득합니다. 획득 시작 후 3 내지 5 분 후에 이미지 안정성 및 감마-델타 상피내 세포 운동성을 확인하고 융모의 각 필드에 대해 30 내지 60 분 동안 이미지를 계속 획득합니다.