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비만 세포(염증 매개체로 채워진 세포질 과립을 포함하는 백혈구)는 선천성 및 적응성 면역 반응에 중요한 역할을 합니다.
복부 장기가 있는 액체로 채워진 공간인 복막강에서 결합 조직형 비만 세포를 분리하려면 누운 자세로 고정된 안락사 마우스를 취합니다. 흉골까지 세로 절개하여 복벽을 노출시킵니다.
복강은 대식세포, 림프구, 다형핵 백혈구 및 비만 세포를 포함한 여러 면역 세포를 포함하는 체액을 포함하는 복벽 아래에 있습니다.
복강 내 내용물을 흡인하는 복막 세척으로 세포를 분리하려면 장기에 구멍을 뚫지 않고 얼음처럼 차가운 성장 배지를 복막강에 주입하여 혈액 누출을 방지합니다. 차가운 배지는 세포 생존력을 유지하는 데 도움이 됩니다.
적절한 시간 동안 마우스를 조심스럽게 흔들어 면역 세포를 배지와 혼합합니다. 빈 주사기를 구멍에 삽입합니다. 배지를 천천히 흡인하여 더 나은 세포 수율을 위해 주입된 유체의 대부분을 회수합니다.
세포 현탁액을 수집 튜브로 옮깁니다. 원심분리하여 세포를 펠릿으로 침전시킵니다. 상청액을 버리십시오. 펠릿을 적절한 배지에 재현탁합니다.
세포를 플레이트하고 생리학적 조건에서 배양하여 세포가 배양 용기에 부착되도록 합니다. 비만 세포의 수용체에 결합하는 특정 사이토카인을 추가하여 세포 증식을 유도합니다.
증식된 세포는 다운스트림 분석을 위한 준비가 되었습니다.
이 절차를 시작하려면 안락사된 마우스에 70% 에탄올을 뿌리고 핀을 사용하여 등쪽이 아래로 향하도록 폼 블록에 고정합니다. 뭉툭한 가장자리 가위를 사용하여 마우스 복부 위의 피부를 제거하고 복막강이 손상되지 않도록 합니다.
다음으로, 복막에 27게이지 바늘을 조심스럽게 삽입하여 복막강에 얼음처럼 차가운 RPMI 배지 7밀리리터를 주입합니다. 장기에 구멍을 뚫지 말고 부고환 지방 부위에 반점을 사용하여 장기 천공의 위험을 줄이십시오.
주사 후 마우스를 1분 동안 흔들어 복막 세포를 RPMI 배지로 분리합니다. 내부 장기를 손상시키거나 복강을 혈액으로 오염시키지 않도록 마우스를 너무 세게 흔들지 마십시오. 그런 다음 주사기에 새 20게이지 캐뉼라를 장착하여 다시 사용하십시오.
폼 블록을 기울이고 벤치를 가볍게 두드려 내부 장기를 한쪽으로 이동하여 다른 쪽에서 중간 흡인이 더 쉬워집니다. 그런 다음 20게이지 바늘을 삽입하여 경사를 위로 하여 복부에서 체액을 부드럽고 천천히 흡인하여 내부 장기에 의해 막히지 않도록 합니다.
가능한 한 많은 체액을 모으십시오. 그런 다음 주사기에서 바늘을 제거하고 수집된 세포 현탁액을 얼음 위의 수집 튜브에 옮깁니다. 눈에 보이는 혈액 오염이 있는 경우 샘플 튜브를 폐기하십시오.
깨끗한 세포 현탁액으로 튜브를 300 x g 5분 동안 원심분리합니다. 멸균 후드 아래에서 상청액을 흡인합니다. 샘플 펠릿을 차가운 PMC 배지에 재현탁하고 세포 현탁액을 25제곱센티미터 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.
그 후, 성장 인자 IL3 및 SCF를 각각 밀리리터당 10나노그램 및 밀리리터당 30나노그램의 최종 농도에 첨가합니다. 다음 절차까지 섭씨 37도에서 약 48시간 동안 세포를 배양합니다.