GM-CSF 생산 T 헬퍼 세포와 나이브 T 세포를 구별하는 체외 기술

과립구-대식세포 콜로니 자극 인자인 GM-CSF는 GM-CSF 생성 T 헬퍼 또는_{T H}GM 세포에 의해 분비됩니다. 이 세포는 다른 T 헬퍼 세포 특이적 사이토카인의 낮은 발현을 나타냅니다.

T_HGM 세포의 시험관 내 분화를 시작하려면 항원 활성화 성숙 세포와 미분화 나이브 세포를 포함하는 마우스 비장에서 분리된 T 헬퍼 세포 현탁

순진한 세포와 성숙한 세포의 특징적인 표면 마커를 표적으로 하는 형광 표지 항체를 추가합니다. 형광 활성화 세포 분류를 수행하여 나이브 T 세포를 분리합니다.

T 세포 수용체 복합체에 결합하는 항체로 코팅된 우물에 세포를 플레이트합니다. 공동 자극 수용체에 결합하는 항체를 추가합니다. 시너지 결합은 세포를 활성화합니다.

사이토카인인 인터루킨 7을 첨가하여 T_HGM 세포로의 분화 및 GM-CSF 생산을 유도합니다. 포르볼 미리스테이트 아세테이트, PMA(염증 유발 화합물), 이오노마이신(칼슘 이오노포어) 및 단백질 수송 억제제를 첨가합니다.

PMA는 세포에 들어가 단백질 키나아제를 활성화합니다. 막투과성 이오노마이신은 세포 내부의 칼슘 이온을 전위시켜 세포내 칼슘 농도를 높입니다.

단백질 키나아제 활성화와 높은 칼슘 수치는 T_HGM 세포를 재자극하는 신호를 시작하여 GM-CSF 생산을 증가시킵니다. 단백질 수송 억제제는 GM-CSF 분비를 차단하여 세포내 검출을 돕습니다.

면역형광 염색을 수행하고, 세포내 사이토카인을 검출하고, 유세포 분석을 사용하여 세포를 분석합니다. GM-CSF 수치는 높지만 다른 사이토카인의 발현이 낮은 대부분의 세포는_{T H}GM 세포로의 성공적인 분화를 나타냅니다.

CD4 양성 T 세포를 분리하려면 백혈구 펠릿을 5밀리리터의 세포 분리 완충액에 재현탁시키고 30마이크로미터 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 새로운 15밀리리터 튜브에 여과하여 파편을 제거합니다. 계수 후, 완충액 농도 90마이크로리터당 1 x 10⁷ 세포로 세포를 재현탁하고, 섭씨 4도에서 15분 동안 배양하기 위해 1 x 10 7 세포당 10마이크로리터의 항-CD4 접합 마그네틱 비드를 첨가하고, 5분마다 혼합합니다.

세포가 배양되는 동안 분리 컬럼을 마그네틱 스탠드에 놓고 컬럼을 2밀리리터의 완충액으로 미리 적십니다. 그런 다음 5밀리리터의 완충액으로 세포를 세척하고 펠릿을 1밀리리터의 완충액에 재현탁합니다. 샘플을 컬럼에 로드하고 CD4 음성 분획을 15밀리리터 원추형 튜브에 수집합니다.

모든 세포가 컬럼을 통과하면 건조되기 전에 세척당 1밀리리터의 완충액으로 저장소를 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 컬럼을 새로운 15밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 컬럼에 2밀리리터의 세포 분리 완충액을 담그어 양성 비드 분획을 배출합니다. 그런 다음 원심분리를 통해 CD4 양성 세포를 수집합니다.

나이브 T 세포의 형광 활성화 세포 분류를 위해, 비드 분류된 CD4 양성 세포 펠릿을 500마이크로리터의 완충액에 재현탁하고 세포를 적절한 형광 접합 항체 칵테일과 혼합합니다. 빛으로부터 보호된 얼음 위에 20-30분 후, 세포를 5밀리리터의 신선한 완충액으로 세척하고 펠릿을 500마이크로리터의 신선한 완충액에 재현탁합니다.

나일론 메쉬를 통해 세포를 여과하고 세포를 500마이크로리터의 완충액으로 사전 코딩된 FACS 튜브로 옮깁니다. CD4 양성, CD25 음성 및 CD44 저 CD62 리간드 고세포 집단을 선택하는 게이트. 그런 다음 순진한 CD4 양성, CD25 음성, CD-44 저, CD-62 리간드 높은 T 세포 분획을 새로운 15밀리리터 원심분리기 튜브에 분류하고 분리된 순진한 CD4 양성 T 세포를 원심분리하여 펠릿화합니다.

과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 또는 GM-CSF, T 도우미 세포 분화를 위해, 50마이크로몰 베타-메르캅토에탄올을 함유하는 완전 RPMI 배지에 밀리리터당 1 x 10⁶ 세포 농도로 분류된 T 세포를 재현탁하고, 사전 코딩된 48웰 플레이트의 각 웰에서 항-CD3 엡실론 항체를 흡인합니다.

그런 다음 IL-7, 항-CD28 및 항-IFN 감마와 함께 각 웰에 2.5 x 10⁵ 세포를 시드하고 세포를 섭씨 37도 및 5% CO₂에서 3일 동안 배양합니다. 배양 3일째에는 현미경을 사용하여 세포 분화를 확인하고 원심분리를 위해 세포를 수확합니다.

릿을 신선한 완전 RPMI 배지에 재현탁하여 두 번 세척하고, 두 번째 세척 후 계산을 위해 세포를 신선한 완전 배지 1밀리리터에 재현탁합니다. 세포를 세 개의 동일한 부피로 분할하고 단백질 수송 억제제의 존재 하에서 4-6시간 동안 PMA와 이오노마이신으로 세포의 첫 번째 분취량을 다시 자극합니다.

자극이 끝나면 항-CD4 항체로 염색하기 위해 세포를 수확합니다. 30분 후, 20-60분 동안 200마이크로리터의 고정 완충액으로 세포를 고정한 후 세척당 투과화 완충액 1밀리리터에 2회 세척합니다. 그런 다음 어둠 속에서 30분 동안 세포내 사이토카인 발현을 염색합니다.