0 조회수 • 4:12 분 • July 8th, 2025
항균제가 박테리아 응집체에 미치는 영향을 연구하려면 응집체 형성을 촉진하는 성장 배지에서 녹농균 배양을 취하여 감염 중 성장을 시뮬레이션합니다.
조작된 박테리아는 형광 현미경에서 응집체 검출을 위해 형광 단백질을 발현합니다. 3차원 이미지를 통해 응집체의 부피 또는 박테리아 바이오매스를 계산하고 시간 경과에 따른 바이오매스의 증가를 시각화하여 박테리아 성장을 나타냅니다.
항생제 내성을 선택하는 동안 민감한 박테리아를 죽이는 치명도 이하의 농도로 양이온성 항균 펩타이드인 콜리스틴을 첨가하십시오.
콜리스틴은 박테리아 외막에 있는 음전하를 띤 지질다당류(LPS)에 결합하여 LPS 단층을 안정화시키는 양이온 가교를 대체하여 막 무결성을 손상시킵니다.
콜리스틴은 주변질에 들어가 세포막의 LPS에 결합하여 막을 파괴하고 세포 용해를 일으킵니다. 반대 메커니즘으로서, 박테리아 하위 집합의 특정 유전적 돌연변이는 LPS의 음전하를 중화합니다. 이 변형은 음이온성 LPS가 적은 양이온성 콜리스틴의 정전기 상호 작용을 억제하여 세포 사멸을 방지합니다.
시간이 지남에 따라 감소하는 바이오매스를 시각화하여 항균제의 영향을 나타내는 이미지입니다. 손상된 막을 통해 들어가 DNA에 결합하고 죽은 세포만 라벨링하는 요오드화 프로피듐 또는 PI(형광 염료)를 추가합니다.
형광 활성화 세포 분류(FACS)를 수행하여 PI 표지 감수성 세포와 형광 표지 항생제 내성 세포를 분리합니다. 세포는 다운스트림 분석을 위한 준비가 되었습니다.
공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 녹농균 응집체를 이미지화하기 위해, 배양이 끝날 때, 배양 플레이트의 3개의 웰을 항생제 치료로 복제하여 하나의 웰을 "무처리 대조군"으로 지정하고 플레이트를 현미경의 가열 단계에 놓습니다.
63배 오일 침지 대물렌즈를 선택하고 찾기 탭을 열어 밝은 필드에서 박테리아 응집체를 식별합니다. 각 웰 내에서 이미징 영역을 정의하고 Positions 모듈을 사용하여 영역 위치를 저장합니다. 여기 파장을 488나노미터로, 방출 파장을 509나노미터로 설정합니다.
획득 모듈에서 Z-스택 옵션을 선택하여 이미지를 획득하고 라인 평균화 모듈을 사용하여 Z-스택 이미지의 총 부피 내에서 GFP 채널의 배경 형광을 줄입니다. 시계열 옵션을 설정하여 18시간 동안 15분 간격으로 각 웰에서 60개의 슬라이스를 캡처하고 명확한 초점 전략을 사용하여 실험 전반에 걸쳐 각 시점에서 다시 이미지화될 각 위치에 대한 초점면을 저장합니다.
이미징 실험을 설정한 후 4.5시간 후에 항생제를 추가하기 전에 각 위치를 이미지화하여 4개의 웰 각각 내에서 총 바이오매스를 결정합니다. 6시간 후, 각 웰의 중간, 공기-액체 계면 바로 아래에 최소 억제 농도보다 2배 낮은 항생제를 부드럽게 추가하고 실험 시작을 클릭하여 항생제 치료 후 이미징을 시작합니다.
살아있는 세포를 분리하려면 18시간의 이미징 기간이 끝날 때 제조업체의 권장 사항에 따라 각 웰의 박테리아에 적절한 양의 요오드화 프로피듐으로 라벨을 붙입니다. 배양이 끝나면 절연 용기를 사용하여 플레이트를 유세포 분석기로 옮기고 70미크론 노즐을 사용하여 GFP 및 요오드화 프로피듐을 검출하도록 세포 분석기를 설정합니다. 그런 다음 가장 낮은 유속에서 각 배양 상청액의 1밀리리터 분취량을 실행하여 생존 가능한 GFP 양성 및 생존 불가능한 요오드화 프로피듐 음성 녹 농균 응집체를 분류합니다.