키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하기 위한 생체 외 기술

인터루킨-2 보충 배지에서 항체 접합 마그네틱 비드와 혼합된 1차 T 세포를 채취하고 배양합니다.

항체는 T 세포 수용체 복합체의 CD3와 공동 자극 수용체 CD28에 결합하는 반면, 인터루킨-2는 동족 수용체에 결합하여 T 세포 활성화 및 증식을 유발합니다.

키메라 항원 수용체 또는 CAR을 암호화하는 형질전환 RNA가 있는 렌티바이러스 벡터를 도입하고 배양합니다.

벡터-세포막 융합 시 바이러스 RNA는 DNA로 역전사되어 숙주 게놈에 통합됩니다.

형질도입된 T 세포는 표면 결합 CAR을 발현합니다.

정의된 간격으로 세포를 수확합니다.

냉동 보존을 위해 세포의 분취량을 가져와 피펫팅으로 결합된 비드를 분리한 다음 자기적으로 분리합니다.

세포를 스핀다운하고 냉동 보존 배지에 재현탁합니다.

세포를 얼리고 극저온에 보관하십시오.

CAR 발현을 평가하려면 세포의 또 다른 분취량을 채취하여 세포를 스핀다운한 다음 완충액에 재현탁합니다.

CAR 특이적 형광 태그 항체를 도입하고 유세포 분석을 사용하여 CAR 발현을 검출합니다.

배양 접시의 웰에서 T 세포당 3개의 비드의 비율로 항-CD3/CD28 마그네틱 비드와 혼합하여 신선 또는 냉동 보존된 일차 인간 T 세포를 활성화합니다. 정상 인간 AB 혈청, L-글루타민, HEPES 및 IL-2가 보충된 X-VIVO 15 배지에서 T 세포를 배양합니다.

확대 시 T 세포를 밀리리터당 100만 개의 농도로 활성화하고 섭씨 37도에서 산소 20%, 이산화탄소 5%, 습도 95%에서 배양합니다. 하룻밤 자극 후 활성화된 T 세포에 렌티바이러스 상청액을 첨가합니다. 3에서 5 사이의 감염 다중도를 달성하는 데 필요한 상청액의 부피를 계산합니다. 동일한 조건을 사용하여 세포를 계속 배양합니다.

3일째에 냉동 보존 세포의 대표적인 분취량을 수집합니다. 냉동 보존 전에 부드럽게 피펫팅하고 자기 분리하여 마그네틱 비드를 제거합니다. 0.5% DMSO가 포함된 PBS가 포함된 동결 배지를 준비하고 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다.

다음으로, T 세포를 300배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 PBS 5밀리리터를 첨가합니다. 세포를 300배 g으로 5분 동안 다시 원심분리하고 PBS를 버립니다. 펠릿을 1밀리리터의 저온 냉동 보존 배지에 재현탁합니다. 차갑게 냉동 용기에 T 세포를 동결하고 섭씨 영하 80도에서 48시간 동안 보관합니다.

그런 다음 냉동 세포