변형된 mRNA를 이용한 일차 대식세포(Primary Macrophage) transfecting

녹색 형광 단백질을 암호화하는 시험관 내 전사 mRNA가 들어 있는 튜브로 시작합니다.

mRNA에는 변형된 뉴클레오티드, 5-메틸-시티딘 삼인산, 슈이두리딘 삼인산이 포함되어 있어 면역 반응을 예방하고 mRNA 안정성을 향상시킵니다.

mRNA의 5'말단은 탈인산화되어 대식세포의 패턴 인식 수용체에 의한 인식을 방지합니다.

mRNA에 양이온성 지질 기반 형질감염 시약을 첨가하여 정전기 상호 작용을 통해 mRNA의 캡슐화를 촉진하고 복합체를 형성합니다.

지질-mRNA 복합체를 마우스 유래 1차 대식세포가 부착된 멀티웰 플레이트에 도입하고 균일한 혼합을 위해 부드럽게 교반합니다.

대식세포는 mRNA 함유 복합체를 엔도좀으로 내재화합니다. 나중에 복합체는 엔도좀막과 융합하여 mRNA를 세포 세포질로 방출합니다.

3' 말단의 폴리-A 꼬리는 단백질 합성을 거쳐 녹색 형광 단백질을 생성하는 mRNA를 안정화시킵니다.

형광 현미경에서 대식세포 내의 녹색 형광은 변형된 mRNA로 성공적인 형질감염을 시사합니다.

미리 계산된 mRNA 형질감염 완충액의 부피에서 mRNA 형질감염 시약 및 mRNA의 부피를 뺀 용량을 반응 튜브에 추가하여 형질감염을 준비합니다. mRNA 스톡을 해동하고 튜브를 뒤집어 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 미리 계산된 부피의 mRNA를 반응 튜브에 추가합니다.

반응 혼합물과 mRNA 형질감염 시약을 소용돌이 및 스핀다운한 다음 적절한 부피의 mRNA 형질감염 시약을 반응 혼합물 튜브에 추가합니다. 튜브를 소용돌이치고 아래로 회전시킨 다음 실온에서 15분 동안 배양합니다. 한편, 대식세포의 배양 배지를 신선하고 따뜻한 배양 배지로 교체하십시오.

형질감염 혼합물의 배양이 완료되면 대식세포가 포함된 플레이트 웰에 혼합물을 웰 외부에서 중앙으로 원형으로 추가합니다. 형질감염 혼합물의 균일한 분포를 보장하려면 플레이트를 수직 및 수평 방향으로 부드럽게 흔듭니다.

그런 다음 플레이트를 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 최소 6시간 동안 배양합니다. 배양 후 형광 현미경, 유세포 분석 또는 면역블롯으로 형질감염 효율을 분석합니다.

이 절차에서 가장 중요한 부분은 모든 대식세포가 동일한 양의 mRNA와 접촉하도록 형질감염 혼합물의 균일한 분포를 보장하는 것입니다.