혼합 3D 배양에서 표적 세포 제거를 위한 근적외선 광면역요법

성장 인자 수용체와 형광 단백질을 발현하는 표적 세포로 구성된 이종 세포 응집체인 행잉 드롭 혼합 스페로이드를 배양하는 반면, 비표적 세포는 다른 색상의 형광 단백질을 발현합니다.

표적 세포 특이적 단클론 항체와 광흡수제 염료를 포함하는 항체-광흡수체 접합체로 배지를 교체합니다.

표적 세포 수용체에 대한 항체 결합을 촉진하기 위해 배양합니다.

스

페로이드를 배지로 세척하여 결합되지 않은 접합체를 제거한 다음 빛 조사를 위해 배지가 있는 유리 바닥 접시로 옮깁니다.

광면역요법을 위해 스페로이드를 근적외선에 노출시켜 표적 세포에서 광흡수제 염료의 광화학 반응을 일으켜 급속한 세포막 손상과 세포 사멸을 일으킵니다.

이 과정은 비표적 세포를 손상시키지 않고 표적 세포를 제거합니다.

스페로이드를 새로 걸린 드롭 플레이트로 옮깁니다. 배지를 추가하고 스페로이드 성장을 위해 배양합니다.

형광 현미경에서 표적 세포 형광이 없으면 효과적인 세포 제거를 나타내는 반면, 비표적 세포 형광이 있으면 광면역요법의 선택적 특성을 확인합니다.

혼합 3D 세포 배양을 준비하려면 96웰 매달린 드롭 플레이트의 플레이트 저장소 섹션에 멸균수 1밀리리터를 추가합니다. 그런 후, 적절한 세포 배양 배지에 관심 세포 유형의 다양한 비율을 웰당 50마이크로리터당 최소 5000개의 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소의 가습 인큐베이터에서 5일 내지 7일 동안 플레이트한다.

2일마다 배양 배지를 교체하고 10-40배 배율의 거꾸로 명시야 현미경으로 매일 스페로이드의 형태와 크기를 관찰합니다. 스페로이드의 직경이 400 내지 600미크론에 도달하면, 매달린 드롭 플레이트 배지를 항체-광흡수체 접합체 함유 배지로 교체하고 플레이트를 인큐베이터에 6시간 동안 되돌립니다.

배양이 끝나면 스페로이드를 신선한 페놀 레드 프리 배양 배지로 두 번 세척합니다. 그런 다음 끝이 절단된 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 접시당 100마이크로리터의 신선한 페놀 레드 프리 배양 배지가 들어 있는 개별 유리 바닥 50mm 접시에 한 번에 하나의 스페로이드를 옮깁니다. 도립 현미경을 사용하여 스페로이드 형태의 변화를 관찰합니다.

스페로이드를 조사하려면 유리 바닥 접시 위 5인치 이하의 발광 다이오드를 놓고 광학 파워 미터를 사용하여 670-710나노미터 파장이 센티미터당 2줄에서 방출되는지 확인합니다. 근적외선 광면역요법 후, 세포 배양 인큐베이터에서 하루 동안 웰당 50