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면역학
0 조회수 • 3:44 분 • July 8th, 2025
두 개의 전기천공 큐벳을 가져 가십시오. 하나의 큐벳에는 자가포식 유도 단백질인 FIP200의 생성을 억제하도록 설계된 작은 간섭 RNA 또는 siRNA가 포함되어 있습니다.
두 번째 큐벳에는 FIP200 생산을 억제하지 않는 대조군으로 스크램블된 siRNA가 포함되어 있습니다.
미성숙 수지상 세포 또는 iDC를 추가합니다. siRNA의 세포 진입을 위해 전기천공한 다음 세포를 플레이트합니다.
내재화된 siRNA는 RNA 유도 침묵 복합체에 결합합니다.
FIP200 특이적 siRNA가 있는 복합체는 표적 mRNA를 절단하여 FIP200 생산을 억제하는 반면, 대조군 siRNA 처리된 iDC는 FIP200을 생성합니다.
세포를 채취하고 단순 포진 바이러스를 추가합니다. 바이러스 외피-세포막 융합 시 방출된 DNA는 핵으로 들어가 바이러스 단백질과 뉴클레오캡시드의 생산으로 이어집니다.
바이러스 단백질은 핵 라민을 파괴합니다. FIP200은 신호 전달 캐스케이드를 유발하는 복합체를 형성하여 파괴된 라민의 자가포식을 유도하여 분해를 표적으로 삼고 바이러스 뉴클레오캡시드가 세포질로 탈출하는 것을 촉진합니다.
FIP200 생산의 siRNA 매개 억제는 라민 자가포식을 제한하여 뉴클레오캡시드 탈출을 방지합니다.
세포는 siRNA 유도 자가포식 억제를 평가할 준비가 되었습니다.
순응 후 3.5일째에 1,200만 iDC를 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 300회 g에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버립니다. 동시에 유세포 분석을 수행하여 성숙 상태를 모니터링합니다.
iDC를 페놀 레드가 없는 OptiMEM 5밀리리터로 부드럽게 세척하고 300배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세포를 200마이크로리터의 OptiMEM에 재현탁하여 세포 농도를 100마이크로리터당 600만 세포로 조정합니다.
FIP200 특이적 또는 스크램블 siRNA 75피카몰을 4mm 전극 큐벳에 첨가하고 100마이크로리터의 세포 현탁액을 해당 큐벳으로 옮깁니다. 전기천공 장치를 사용하여 iDC를 직접 펄스합니다.
전기천공 후, iDC를 신선한 예열된 DC 배지가 있는 6웰 플레이트로 옮기고 밀리리터당 100만 세포의 최종 농도로 세포를 파종하고 인큐베이터에 넣습니다. 48시간 후, 전기천공된 iDC의 형태를 현미경으로 검사한 다음 세포 스크레이퍼로 세포를 수확하여 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.
0.01% EDTA가 보충된 PBS 1밀리리터로 웰을 헹구고 용액을 각 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 원고에 설명된 대로 각 siRNA 조건에 대한 세포를 분할합니다.
500,000개의 세포를 사용하여 성숙 상태와 세포 생존력을 평가합니다. 웨스턴 블롯 분석에 100만 개의 세포를 사용하여 200개의 특정 녹다운 효율을 검증하고 나머지 세포를 HSV-1 감염 실험에 사용합니다.