0 조회수 • 4:42 분 • July 8th, 2025
일차 비장 세포와 혼합된 레트로바이러스 벡터를 복용하십시오.
벡터에는 종양 특이적 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 또는 CAR을 암호화하는 형질전환 RNA가 포함되어 있습니다.
배지 내 사이토카인 인터루킨-2는 T 세포 증식을 선택적으로 촉진하는 반면 다른 세포는 결국 사멸합니다.
혼합물을 재조합 피브로넥틴 단편으로 코팅된 마이크로플레이트로 옮깁니다.
원심분리하여 벡터와 T 세포에 결합하는 피브로넥틴 단편을 촉진하고 바이러스-숙주 세포 상호작용을 매개하고 배양합니다.
벡터의 외피가 세포막과 융합되면 바이러스 효소는 방출된 RNA를 DNA로 역전사하여 숙주 게놈에 통합합니다.
형질도입된 T 세포는 종양 특이적 항원을 표적으로 하는 세포외 항체 가변 단편과 항원에 반응하는 세포내 신호 전달 영역으로 구성된 표면 결합 CAR을 발현합니다.
세포를 튜브로 옮기기 전에 재현탁하십시오.
원심분리하여 내재화되지 않은 바이러스를 포함하는 상청액을 버리고 다운스트림 분석을 위해 세포를 완충액에 재현탁합니다.
비장 절제술 다음날, 밀리리터당 25마이크로그램의 재조합 인간 피브로넥틴 단편 또는 RHFF를 함유한 PBS를 준비하고, 각 웰에 0.5밀리리터의 용액을 첨가하여 비조직 배양 처리된 24웰 플레이트를 코팅한다. 다음날 웰에서 용액을 제거하고 PBS에 웰당 2% BSA당 1밀리리터를 첨가합니다.
실온에서 30분 동안 배양한 다음 2밀리리터의 PBS를 첨가하여 세척하기 전에 플레이트를 단단히 뒤집어 BSA를 제거합니다. HEK293T 세포에서 바이러스 상청액을 수집한 후, RHFF 코팅 웰의 수에 추가 3밀리리터를 더한 것과 동일한 최종 부피(밀리리터)에 신선한 TCM을 추가합니다.
배양된 비장세포를 인큐베이터에서 제거하고 각 웰에서 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 재현탁합니다. 세포 현탁액을 50밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 비장 세포를 바이러스 상청액에 밀리리터당 1 x 106 세포로 재현탁합니다.
그런 다음 RHFF 코팅 플레이트의 웰에 비장세포 현탁액의 웰당 1밀리리터를 추가합니다. 이제 섭씨 90도, 32g초에서 770g s에서 가속도 4, 브레이크 설정 0으로 플레이트를 90분 동안 회전시킵니다. 스핀하는 동안 TCM에서 재조합 인간 IL-2 밀리리터당 50 국제 단위를 준비합니다.
탈수 후 플레이트의 각 웰에 배지 1밀리리터를 넣고 밤새 배양합니다. T 세포가 80% 이상의 합류에 도달하면 각 웰에서 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 2-3회 분할한 다음 각 웰에서 1밀리리터를 신선한 24웰 조직 배양 처리 플레이트의 새 웰로 옮깁니다.
각 웰에 IL-2 밀리리터당 50 국제 단위와 함께 신선한 TCM 1밀리리터를 추가합니다. 세포가 80% 합류에 도달하지 않으면 각 웰 상단에서 배지 1밀리리터를 천천히 피펫팅하고 재조합 인간 IL-2 밀리리터당 50국제 단위를 포함하는 신선한 TCM 1밀리리터로 교체하여 배지의 절반을 변경합니다.
각 웰에서 위아래로 세 번 부드럽게 피펫팅하여 CAR T 세포를 재현탁하고 250밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 세포를 300g에서 10분 동안 회전시킵니다. 다음으로 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 완전히 흡인합니다. PBS를 사용하여 세포를 세척한 다음 두 번째로 세척하기 전에 계산합니다. 일반적인 CAR T 세포 수율은 웰당 약 1 x 106 세포입니다.