T 세포의 유전자 편집을 위한 CRISPR-Cas9 기술

전기 펄스가 세포막에 일시적인 기공을 생성하는 과정인 전기천공에 적합한 배지에 현탁된 T 세포를 가져 가십시오.

Cas9 단백질과 단일 가이드 RNA 또는 sgRNA를 포함하는 복합체를 추가합니다. sgRNA는 분자 가위인 Cas9를 절단을 위해 DNA의 특정 위치로 지시하는 작은 RNA입니다.

Cas9-sgRNA 복합체를 세포로 운반하는 데 도움이 되는 짧은 단일 가닥 DNA 분자를 추가합니다.

이 혼합물을 큐벳으로 옮기고 짧은 전기 펄스를 가하여 전기천공을 시작합니다.

이 과정을 통해 복합체가 세포에 들어갈 수 있습니다.

sgRNA는 T 세포 DNA의 표적 부위에 결합하여 Cas9가 DNA를 편집하여 두 가닥 모두에 절단을 만들 수 있도록 합니다.

이 파괴는 복구 단백질이 해당 부위에 신호를 보냅니다.

그런 다음 복구 단백질은 말단을 다시 연결하여 유전자를 기능하지 않게 만듭니다.

유전자 편집 T 세포를 다운스트림 분석에 적합한 배지에서 배양합니다.

10마이크로그램의 Cas9 뉴클레아제와 5마이크로그램의 단일 가이드 RNA를 실온에서 10분 동안 배양하여 리보핵단백질 또는 RNP 복합체를 준비합니다. 단일 가이드 RNA가 없는 모의 대조군을 포함합니다. 재현탁된 T 세포를 RNP 복합체와 결합하고 4.2마이크로리터의 4마이크로몰 전기천공 강화제를 첨가합니다. 잘 섞은 후 전기천공 큐벳으로 옮깁니다.

펄스 코드 EH-1-11을 사용하여 셀을 전기 도금합니다. 그런 다음 밀리리터당 500만 개의 세포를 R-10에서 배양하고, 밀리리터당 5나노그램의 인간 IL-7 및 인간 Il-15를 섭씨 30도에서 12웰 플레이트에서 48시간 동안 배양합니다. 배양 후 T 세포 활성화 및 증식을 진행합니다.