0 조회수 • 2:58 분 • July 8th, 2025
감기 적응 인플루엔자 균주의 특정 바이러스 필수 단백질을 암호화하는 cDNA를 운반하는 양방향 플라스미드로 시작합니다.
다른 인플루엔자 균주의 헤마글루티닌과 변형된 뉴라미니다제 cDNA를 포함하는 새로운 양방향 플라스미드 세트를 도입합니다.
이 혼합물에 형질감염 시약을 도입하고 배양하여 플라스미드와 복합체를 형성합니다.
이러한 복합체를 배양된 인간 상피 유사 세포로 전달하여 플라스미드가 세포에 진입할 수 있도록 합니다.
반대 방향에 있는 두 개의 프로모터를 가진 양방향 플라스미드는 바이러스 단백질과 해당 RNA의 생산을 가능하게 합니다.
더 낮은 온도에서 세포를 배양합니다.
바이러스 단백질과 바이러스 RNA는 자가 조립되어 따뜻한 조건에서 복제가 감소된 저온 적응 재조합 인플루엔자 바이러스를 형성합니다.
시알산을 과발현하는 MDCK 세포와 세포 내부에 바이러스 부착 및 진입을 허용하는 변형된 트립신 효소와 오버레이합니다.
동일한 온도에서 배양하여 새로운 바이러스의 복제 및 생산을 유도합니다.
백신 준비를 위해 준비된 재조합 약독화 생인플루엔자 바이러스를 원심분리하고 수확합니다.
시작하려면 10% 소 태아 혈청과 1% 펜 패혈성 패혈성을 포함하는 DMEM으로 6웰 플레이트의 각 웰에 백만 개의 293T 세포를 도금합니다. 다음으로, 웰당 100마이크로리터에 충분한 플라스미드 형질감염 혼합물을 준비합니다. 각 플라스미드의 마이크로그램을 결합하고 튜브에 예열된 Opti-MEM 세포 배지로 50마이크로리터까지 채웁니다. 다른 튜브에 형질감염할 플라스미드의 총 양에 해당하는 리포펙타민 2000의 두 배를 추가하고 Opti-MEM으로 튜브를 50마이크로리터까지 추가합니다.
형질감염 혼합물을 세포에 첨가하기 전에 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 100마이크로리터의 형질감염 혼합물을 각 웰에 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 16시간 동안 옮깁니다. 다음날 배지를 0.3% BSA 및 1% 펜 연쇄상구균이 포함된 DMEM으로 변경합니다. 그러면. 세포를 섭씨 33도, 이산화탄소 5%로 5시간 동안 이동합니다.
5시간 후, 트립신이 보충된 DMEM에 백만 개의 인플루엔자 허용 MDCK 세포를 오버레이합니다. 바이러스를 생성하고 증폭시키기 위해 섭씨 33도 배양 체제에서 2-3일 동안 공동 배양을 유지합니다. 나중에 5분 동안 260g 회전하여 잔해물을 제거한 다음 상청액을 수집합니다.