종양 특이적 CAR T 세포의 항종양 활성을 평가하기 위한 In vitro 분석

B 세포 특이적 표면 항원과 세포질 루시페라아제 효소를 발현하는 B 세포 림프종 종양 세포가 들어 있는 멀티웰 플레이트를 가져 와서 섭취하십시오.

CAR T 세포를 선택한 웰에 도입하고 배양합니다. 세포는 종양 항원을 표적으로 하는 세포외 도메인과 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 CAR(CAR)을 발현합니다.

CAR은 종양 항원에 결합하여 CAR T 세포의 활성화를 유도합니다.

활성화된 세포는 세포의 항종양 활성을 촉진하는 사이토카인을 방출하여 독소 방출을 유발합니다.

독소는 종양 세포에 들어가 세포 사멸을 유도합니다.

세포를 회전시키고 상청액을 분리합니다. CAR T 세포 활성을 평가하기 위해 사이토카인을 정량화합니다.

생물발광 기질인 루시페린을 함유한 완충액에 세포를 재현

탁합니다.

루시페린은 진입 시 살아있는 종양 세포의 루시페라아제에 의해 산화되어 빛을 방출합니다.

생물발광을 측정하여 처리된 종양 세포에서 감소된 신호를 식별하여 CAR T 세포 매개 세포독성을 확인합니다.

먼저, 루시페라아제 발현 유무에 관계없이 10,000개의 동계 표적 CD19 양성 종양 세포와 100마이크로리터의 TCM을 96웰 U-바닥 조직 배양 플레이트의 각 웰에 시드합니다. 각 웰에 10,000개의 CD19 CAR T 세포와 100마이크로리터의 TCM을 추가합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 컨트롤을 설정합니다. 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 16-24시간 동안 공동 배양합니다. 그런 다음 플레이트를 500배g에서 5분 동안 원심분리합니다. 추가 인터페론-감마 및 인터루킨-12 p70 ELISA 분석을 위해 상청액을 수집합니다.

루시페린을 함유한 PBS 100마이크로리터에 세포 펠릿을 재현탁하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 발광계를 사용하여 각 우물의 발광을 측정합니다.