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자연 살해 또는 NK 세포와 암세포가 들어 있는 멀티웰 플레이트를 가져 가십시오. 대조군 우물에는 암세포만 포함되어 있습니다.
세포 접촉을 용이하게 하기 위해 원심분리기.
인큐베이트. NK 세포의 활성화 수용체는 암세포 표면 리간드에 결합하여 NK 세포가 세포독성 분자를 포함하는 과립을 방출하도록 유도합니다.
이 분자는 암세포막 기공을 생성하고 세포사멸을 유도하여 젖산 탈수소효소(LDH)를 포함한 세포내 내용물을 방출합니다.
LDH 방출을 극대화하기 위해 대조군 웰에서 암세포를 용해하기 위해 세제를 첨가하십시오.
LDH 함유 상청액의 일부를 원심분리하여 분석 플레이트로 옮깁니다.
분석 시약을 첨가하고 배양합니다.
LDH는 젖산을 피루브산으로 전환하여 NAD+를 감소시킵니다. 디아포라제는 NADH를 사용하여 테트라졸륨염을 감소시켜 빨간색 포르마잔 생성물을 형성합니다.
효소 반응을 멈추기 위해 산성 용액을 첨가하십시오.
마이크로플레이트 리더를 사용하여 웰의 포르마잔 흡광도를 측정합니다.
포르마잔 강도는 테스트 웰에서 용해된 암세포의 수에 비례하며, 이는 암세포에 대한 NK 세포 세포 독성을 나타냅니다.
먼저, 둥근 바닥 배양 처리된 96웰 플레이트를 얻고 텍스트 프로토콜의 표 1에 설명된 대로 설정합니다. 분석 플레이트를 250배 g에서 4분 동안 원심분리하여 이펙터와 표적 세포가 접촉하는지 확인합니다. 다음으로, 플레이트를 섭씨 37도의 가습 챔버에서 5% 이산화탄소와 함께 5시간 동안 배양합니다.
상청액을 수확하기 45분 전에, 10마이크로리터의 10x 용해 용액을 표적 세포 최대 LDH 방출 웰에 첨가하고 플레이트를 가습 챔버로 되돌립니다. 배양이 완료되면 플레이트를 250배 g에서 4분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 다중 채널 피펫터를 사용하여 모든 웰에서 50마이크로리터 분취량을 새로운 96웰 평평한 바닥 분석 플레이트로 옮깁니다.
분석 플레이트의 각 웰에 50마이크로리터의 분석 시약을 추가합니다. 접시를 호일로 덮어 빛으로부터 보호하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 50마이크로리터의 정지 용액을 추가합니다. 정지 용액을 첨가한 후 1시간 이내에 플레이트를 판독하고 490나노미터에서 흡광도를 기록하십시오.