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면역학
0 조회수 • 3:32 분 • July 8th, 2025
재조합 피브로넥틴 단편으로 코팅된 마이크로웰 플레이트를 가져와 활성화된 쥐 CD8 양성 T 세포를 추가합니다.
키메라 항원 수용체 또는 CAR을 암호화하는 형질전환 RNA를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 도입합니다.
접시를 덮고 오염을 방지하기 위해 가방에 밀봉하십시오. 바이러스-세포 상호작용을 촉진하기 위해 플레이트를 저속으로 원심분리합니다.
피브로넥틴은 바이러스와 세포에 결합하여 공국소화하여 바이러스 매개 유전자 전달을 향상시킵니다.
원심분리 후 밀봉된 백을 제거하고 생리학적 조건에서 플레이트를 배양합니다.
바이러스 벡터의 외피는 세포막과 융합하여 바이러스 RNA와 효소를 방출합니다.
바이러스 효소는 방출된 RNA를 역전사하고 생성된 DNA를 숙주 게놈에 통합하여 세포가 표면 결합 CAR을 발현할 수 있도록 합니다.
CAR은 표적 항원에 특이적인 항원 결합 도메인과 T 세포 활성화를 위한 신호 전달 도메인을 포함합니다.
항원 특이적 CAR T 세포는 다운스트림 분석을 위한 준비가 되었습니다.
1일째에 24웰 플레이트의 웰에 0.5밀리리터의 피브로넥틴을 첨가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양하여 인간 피브로넥틴 단편 코팅 플레이트를 준비합니다.
다음날, 피브로넥틴 용액을 제거하고 웰당 PBS에 2% BSA 1밀리리터를 첨가합니다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양하고 처리된 웰을 멸균 PBS 1밀리리터로 세척합니다. 세척액을 제거한 후 플레이트를 사용할 준비가 된 것입니다.
트리판 블루를 사용하여 활성화된 CD8 T 세포를 계산합니다. 원심분리로 수집하고 형질도입을 위해 밀리리터당 500만 개의 생존 세포로 재현탁합니다. 100마이크로리터의 활성화된 CD8 세포 현탁액을 피브로넥틴 코팅 플레이트의 각 웰에 첨가합니다. 그런 다음 미리 준비된 바이러스 함유 배지 1.5-2밀리리터를 첨가하고 소용돌이치는 동작으로 혼합하여 세포를 고르게 분배합니다.
플레이트를 지퍼백에 밀봉하고 섭씨 37도에서 90분 동안 2000배g으로 원심 분리합니다. 원심분리기에서 플레이트를 제거하고 생물학적 안전 캐비닛으로 가져갑니다. 비닐봉지를 조심스럽게 제거하고 접시 외부가 매체로 오염되지 않았는지 확인하십시오. 플레이트를 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터로 옮깁니다.
4시간 후 각 웰에서 배지 1밀리리터를 제거합니다. 예열된 완전 T 세포 배지 1밀리리터로 교체하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.