항혈인성 종양 관련 호중구 생성

종양 관련 호중구 또는 TAN을 포함하는 쥐 흑색종 종양을 예로 들어 보겠습니다.

TAN은 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제 또는 NAMPT 효소의 활성이 높아져 혈관신생, 종양의 혈관 증식을 자극하고 종양 성장을 촉진합니다.

조직을 다지고 효소를 첨가하여 조직 기질을 분해하여 세포를 느슨하게 합니다.

스

트레이너와 원심분리기를 통해 현탁액을 여과하여 세포를 펠릿화합니다.

용해 완충액을 첨가하여 적혈구를 용해한 다음 원심분리하여 세포 파편이 포함된 상청액을 버립니다.

항체를 도입하여 세포 Fc 수용체를 차단하여 비특이적 면역염색을 피합니다.

TAN의 표면 마커에 특이적인 형광단 표지 항체 칵테일과 죽은 세포를 구별하기 위한 염료를 도입합니다.

FACS를 사용하여 형광단으로 표지된 생존 가능한 TAN을 분리하고 마이크로플레이트로 옮깁니다.

선택한 웰에 NAMPT 활성을 차단하는 억제제를 추가하고 배양합니다.

세포를 사용하여 혈관신생 자극 능력을 평가합니다. 억제제 처리된 TAN은 처리되지 않은 TAN에 비해 감소된 혈관신생을 보여줍니다.

종양 관련 호중구 분리를 위해, 웰당 5개의 종양을 수확될 때 멸균 6웰 플레이트의 개별 웰에 넣고 멸균 가위를 사용하여 종양을 2-3mm 조각으로 잘게 썬다. 다음으로, 1밀리리터의 디스크 기반 콜라게나제, DNase I 용액으로 섭씨 37도 및 습도 5% 이산화탄소에서 45분 동안 종양 조각을 분해하고 15분마다 10밀리리터 주사기로 샘플을 혼합합니다.

배양이 끝나면 100마이크로미터 스트레이너를 통해 세포를 웰당 15밀리리터 튜브 1개로 여과하여 소화되지 않은 섬유를 제거하고 PBS를 최종 부피 15밀리리터까지 첨가합니다. 원심분리에 의해 해리된 세포를 수집하고 튜브당 1밀리리터의 용해 완충액으로 적혈구를 용해합니다.

혼합 후 각 튜브의 내용물을 단일 15밀리리터 튜브에 결합하고 11밀리리터의 완전한 섭씨 4도 배지로 2분 후에 반응을 중지합니다. 원심분리 후, 펠릿을 1밀리리터의 PBBS에 재현탁시키고, 3마이크로리터의 FC 차단 항체로 얼음 위에서 15분 동안 비특이적 결합을 차단합니다.

배양이 끝나면 항-CD11b 및 Ly6G 항체 및 기타 관심 항체와 DAPI로 세포를 라벨링하여 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 PBS 14밀리리터로 세포를 세척하고 펠릿을 밀리리터당 1 x 10⁷ 세포의 신선한 완전 배지 농도로 얼음 위에 재현탁합니다.

그런 다음 표준 분류 프로토콜에 따라 형광 활성화 세포 분류기에서 CD11b 양성 Ly6G 높은 DAPI 음성 호중구를 분류하고 분류가 끝날 때 유세포 분석기에서 분리된 호중구의 순도를 확인합니다. 시험관 내 종양 관련 호중구 억제를 위해, 96웰 U-바닥 플레이트의 2개의 웰 각각에 5번째 분류된 호중구를 1.5배 10배 시드하고, FK866을 완전 배지에서 100나노몰의 최종 농도에 하나의 웰에 첨가하고, 동일한 부피의 완전 배지 단독을 다른 웰에 첨가한다. 세포 배양 인큐베이터에서 2시간 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 후속 주입을 위해 적절한 농도로 PBS에 펠릿을 재현탁합니다.