유도 만능 줄기 세포에서 단일 양성 CD8 T 세포 생성

배양은 젤라틴 매트릭스의 간질 세포의 피더 층에 만능 줄기 세포를 유도했습니다.

피더층은 자연적인 세포외 환경을 모방하여 줄기 세포가 조혈 전구 세포를 포함하는 돔 모양의 오가노이드로 분화되도록 안내합니다.

효소를 첨가하여 공동 배양된 세포를 해리시킵니다.

간질 세포 접착을 위해 세포를 신선한 젤라틴 코팅 접시로 옮깁니다.

부착되지 않은 조혈 전구 세포를 분화 배지에 수집합니다.

CD4 및 CD8 수용체가 있는 이중 양성 T 세포와 두 수용체가 모두 결여된 이중 음성 T 세포로의 전구 세포 분화를 촉진하기 위해 신선한 피더 층에서 배양합니다.

세포를 튜브로 옮깁니다. 이중 양성 T 세포에 선택적으로 태그를 지정하는 CD4 특이적 항체를 운반하는 마그네틱 비드와 함께 배양합니다.

자기 분리기를 사용하여 이중 양성 세포를 분리하고 신선한 피더 층에서 배양합니다.

사이토카인과 항체 혼합물을 보충하여 세포를 자극하여 CD4 수용체 하향 조절을 유도하고 CD8-단일 양성 세포로의 분화를 촉진합니다.

인간 IPSC와 공동 배양하기 1주일 전에 젤라틴화된 OP9-delta-1 접시를 준비합니다. 3개의 새로운 세포 배양 접시에 0.1% 젤라틴 4밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 젤라틴을 흡인하고 각 접시에 8밀리리터의 OP9 배지를 추가합니다. OP9-델타-1 세포의 융합 접시 1개를 젤라틴 코팅 접시 3개에 계대시킵니다.

4일 후, 세포의 각 접시에 10밀리리터의 OP9 배지를 추가하여 접시당 총 20밀리리터의 배지를 추가합니다. 세포를 계대 후 7-8일 후에 OP9-델타-1 합류 접시에서 인간 IPSC 공동 배양을 시작합니다. 인간 IPSC의 합류 접시에서 배지를 흡인하고 10밀리리터의 OP9 배지를 추가합니다.

일회용 세포 계대 도구를 사용하여 세포 콜로니를 절단 및 분리하고, 350-600개의 절단된 콜로니 덩어리를 10밀리리터의 신선한 OP9 배지와 함께 사전 젤라틴화된 OP9-델타-1 접시에 옮깁니다. 식민지의 균일한 분포를 보장하기 위해 배양 접시를 좌우, 앞뒤로 흔듭니다. 다음날 사용한 배지를 흡인하고 20밀리리터의 신선한 OP9 배지로 교체합니다.

OP9-delta-1에서 하루 동안 공동 배양된 인간 IPSC 덩어리는 작고 둥근 단층 콜로니로 나타나야 합니다. 5일째에 사용한 배지 10밀리리터를 흡인하고 신선한 OP9 배지 10밀리리터를 추가합니다. 식민지는 다층의 어두운 중심을 특징으로 하는 원시 중배엽으로 분화하기 시작합니다.

9일째에 이 과정을 반복하면 다층 중심 구조가 돔 모양으로 진화합니다. 13일째에 조혈 전구 세포를 수확하며, 이 시점에서 구조는 돔 모양의 영역 네트워크로 둘러싸인 어두운 중앙 오가노이드로 구성됩니다. 배지를 흡인하고 칼슘과 마그네슘 또는 HBSS가 포함된 1x 페놀 레드 프리 행크의 균형 소금 용액 5밀리리터로 세포를 한 번 세척합니다.

세척 후 밀리리터당 5,000단위의 250마이크로리터를 콜라게나제-4에서 10밀리리터의 HBSS를 추가합니다. 혼합물을 세포에 첨가하고 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. HBSS-콜라게나제 혼합물을 흡인하고 PBS 5밀리리터로 세포를 한 번 세척합니다. PBS로 세척한 후 0.25% 트립신-EDTA 5밀리리터를 넣고 세포를 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.

그런 다음 4밀리리터의 OP9 배지를 첨가하고 피펫팅으로 세포층을 결합하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 세포 현탁액을 100마이크로미터 스트레이너를 통해 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 튜브를 300배 g 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 세포를 10밀리리터의 OP9 배지에 재현탁합니다.

새로운 젤라틴화된 10cm 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 플레이트하고 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 부드럽게 피펫팅하여 부착되지 않은 세포를 수집합니다. 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 50밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 앞서 설명한 대로 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 흡인하고 세포를 10밀리리터의 분화 배지에 재현탁합니다.

세포 현탁액을 새로운 OP9-delta-1 합류 접시에 도금합니다. 원고 지침에 따라 16일째에 세포를 계대시키고, 그 이후에는 5-7일마다 비부착 세포를 계속 계대합니다. 분화 35일 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 CD4 마그네틱 비드 분리에 의해 CD4 양성 세포 집단을 농축합니다.

그런 다음 세포를 OP9 배지에 재현탁하고 합류 OP9-델타-1의 조직 배양 평평한 바닥 24웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 1밀리리터를 플레이트합니다. 각 웰에 100 국제 단위의 인간 IL-2, 5 나노그램의 인간 IL-7, 500 나노그램의 항-인간 CD3 항체 및 2 마이크로그램의 항-인간 CD28 항체를 첨가하여 세포를 자극합니다. 4-7일 후에 추가 분석을 위해 세포를 수집할 수 있습니다.