유도 만능 줄기 세포에서 단일 양성 CD8 T 세포 생성

배양은 젤라틴 매트릭스의 간질 세포의 피더 층에 만능 줄기 세포를 유도했습니다.

피더층은 자연적인 세포외 환경을 모방하여 줄기 세포가 조혈 전구 세포를 포함하는 돔 모양의 오가노이드로 분화되도록 안내합니다.

효소를 첨가하여 공동 배양된 세포를 해리시킵니다.

간질 세포 접착을 위해 세포를 신선한 젤라틴 코팅 접시로 옮깁니다.

부착되지 않은 조혈 전구 세포를 분화 배지에 수집합니다.

CD4 및 CD8 수용체가 있는 이중 양성 T 세포와 두 수용체가 모두 결여된 이중 음성 T 세포로의 전구 세포 분화를 촉진하기 위해 신선한 피더 층에서 배양합니다.

세포를 튜브로 옮깁니다. 이중 양성 T 세포에 선택적으로 태그를 지정하는 CD4 특이적 항체를 운반하는 마그네틱 비드와 함께 배양합니다.

자기 분리기를 사용하여 이중 양성 세포를 분리하고 신선한 피더 층에서 배양합니다.

사이토카인과 항체 혼합물을 보충하여 세포를 자극하여 CD4 수용체 하향 조절을 유도하고 CD8-단일 양성 세포로의 분화를 촉진합니다.

인간 IPSC와 공동 배양하기 1주일 전에 젤라틴화된 OP9-delta-1 접시를 준비합니다. 3개의 새로운 세포 배양 접시에 0.1% 젤라틴 4밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 젤라틴을 흡인하고 각 접시에 8밀리리터의 OP9 배지를 추가합니다. OP9-델타-1 세포의 융합 접시 1개를 젤라틴 코팅 접시 3개에 계대시킵니다.

4일 후, 세포의 각 접시에 10밀리리터의 OP9 배지를 추가하여 접시당 총 20밀리리터의 배지를 추가합니다. 세포를 계대 후 7-8일 후에 OP9-델타-1 합류 접시에서 인간 IPSC 공동 배양을 시작합니다. 인간 IPSC의 합류 접시에서 배지를 흡인하고 10밀리리터의 OP9 배지를 추가합니다.

일회용 세포 계대 도구를 사용하여 세포 콜로니를 절단 및 분리하고, 350-600개의 절단된 콜로니 덩어리를 10밀리리터의 신선한 OP9 배지와 함께 사전 젤라틴화된 OP9-델타-1 접시에 옮깁니다. 식민지의 균일한 분포를 보장하기 위해 배양 접시를 좌우, 앞뒤로 흔듭니다. 다음날 사용한 배지를 흡인하고 20밀리리터의 신선한 OP9 배지로 교체합니다.

OP9-delta-1에서 하루 동안 공동 배양된 인간 IPSC 덩어리는 작고 둥근 단층 콜로니로 나타나야 합니다. 5일째에 사용한 배지 10밀리리터를 흡인하고 신선한 OP9 배지 10밀리리터를 추가합니다. 식민지는 다층의 어두운 중