쥐 해마 뉴런을 배양하는 기술

수확한 쥐 새끼 해마를 완충 장치에 넣으십시오.

해마를 더 작은 조각으로 자르고 원추형 튜브로 옮깁니다.

완충액으로 조직을 씻으십시오. 조각이 가라앉으면 버퍼를 제거합니다. 이제 새로운 완충액과 트립신을 추가합니다.

배양하는 동안 단백질 분해 효소인 트립신은 조직의 세포외 기질을 소화하여 해마 뉴런을 느슨하게 합니다.

소화된 조직을 완충액으로 세척합니다.

조각이 가라앉으면 버퍼를 제거합니다. 신선한 완충액을 추가하고 조직을 반복적으로 피펫팅하여 기계적으로 해리시켜 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

소화되지 않은 조직이 침전되면 세포 현탁액을 배지가 들어 있는 배양 플레이트 내에서 왁스 지지대가 있는 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립에 옮깁니다.

세포는 정전기 상호 작용을 통해 폴리-L-라이신 코팅 표면에 부착됩니다.

이제 뉴런 부착 커버슬립을 아래를 향하여 무혈청 배지에 피질 신경교 또는 비뉴런 세포가 들어 있는 접시에 놓습니다.

배양에서 왁스 지지체는 뉴런과 신경교세포 사이의 직접적인 접촉을 방지하여 신경교세포 분비 인자가 신경세포 생존과 성숙을 촉진하는 미세 환경을 조성합니다.

시작하려면 페트리 접시에 HBSS 배지로 출생 후 1일 된 새끼의 해마 6-8개를 해부합니다. 해부 가위로 해마를 작은 조각으로 자르고 접시에서 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 해마를 HBSS 5ml로 두 번 세척하고 세척 후 HBSS 4.5ml에 그대로 둡니다.

HBSS 4.5ml에 2.5% 트립신 0.5ml를 넣고 섭씨 37도 수조에서 15분 동안 배양하고 5분마다 튜브를 반전시킵니다. 잘 소화된 해마는 끈적거리고 클러스터를 형성해야 합니다. 필요한 경우 소화를 5분 더 연장하십시오.

해마를 HBSS로 세척할 때마다 5분 동안 세 번 세척합니다. 세척 후 HBSS 2밀리리터를 넣고 파스퇴르 피펫으로 해마를 위아래로 15회 피펫팅합니다. 불에 연마된 파스퇴르 피펫으로 티슈를 10회 분쇄하고 모든 덩어리가 바닥으로 고정될 때까지 튜브를 5분 동안 그대로 둡니다. 나머지 덩어리의 대부분이 사라질 때까지 분쇄를 반복합니다.

그런 다음 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 해리된 뉴런이 포함된 상청액을 도금 접시로 부드럽게 옮깁니다. 미리 배양된 도금 배지에 직접 넣고 플레이트를 부드럽게 흔듭니다. 파종 후 2-4시간 후에 광학 현미경으로 도금 접시를 확인하십시오. 대부분의 뉴런은 커버슬립에 부착되어 있어야 합니다.

끝이 가는 집게를 사용하여 왁스 도트 면이 아래를 향하도록 사전 조절된 신경 배양 배지가 들어 있는 신경교 세포 피더 접시로 커버슬립을 뒤집습니다. 뉴런은 최대 한 달 동안 아교세포 피더 접시에서 자랄 수 있습니다. 7일마다 뉴런에 1밀리리터의 신선한 뉴런 배양 배지를 공급합니다.