0 조회수 • 5:51 분 • July 8th, 2025
형질전환 쥐 새끼 뇌를 예로 들어 보겠습니다.
소뇌를 제거하고 뇌를 해부합니다. 형광 단백질 발현 흥분 뉴런을 포함하는 피질-해마 조직을 분리합니다.
조직을 완충액이 들어 있는 배양 플레이트로 옮깁니다.
조직을 다진 다음 파파인이 들어 있는 튜브에 옮깁니다.
파파인은 조직의 세포외 기질을 소화하여 뉴런을 포함한 세포를 느슨하게 합니다.
소화된 조직을 BSA 단백질이 있는 튜브로 옮겨 효소 활성을 멈추고 세포 손상을 방지합니다.
조직을 기계적으로 해리시켜 세포를 방출합니다.
원심분리하여 파편과 효소가 포함된 상청액을 제거합니다.
저형광 신경 배지에 세포를 재현탁하고 세포 스트레이너를 통해 여과하여 세포 응집체를 제거합니다.
형광 활성화 세포 분류를 수행하여 형광 뉴런을 식별하고 분류합니다.
분류된 뉴런을 미세 원심분리기 튜브 및 원심분리기로 옮깁니다. 뉴런 매질에 뉴런을 재현탁합니다.
멀티웰 플레이트의 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립에 뉴런을 시드합니다. 뉴런은 코팅된 표면에 부착됩니다.
뉴런 미디어를 추가합니다. 신경 성장을 촉진하기 위해 배양합니다.
먼저 소뇌를 해부하고 두 반구를 분리합니다. 그런 다음 해마와 피질을 각 반구에서 조심스럽게 분리합니다. 해부된 조직을 냉각된 세포 배양 완충액이 들어 있는 35mm 페트리 접시로 옮깁니다.
그런 다음 해부된 해마와 피질을 다른 35mm 페트리 접시의 뚜껑으로 옮깁니다. 메스 칼날의 평평한 가장자리를 사용하여 작은 조각만 남을 때까지 십자형 동작으로 조직을 조심스럽게 자릅니다.
다음으로, 소량의 파파인 용액이 포함된 다진 조직을 페트리 접시 뚜껑에서 멸균 파파인 튜브로 옮깁니다. 조직을 섭씨 37도에서 25분 동안 배양합니다. 파파인 배양 후 멸균 파파인 튜브와 멸균 BSA 튜브를 흐름 캐비닛으로 옮깁니다. 그런 다음 1밀리리터 파스퇴르 피펫을 사용하여 파파인 튜브에서 BSA 튜브 1로 피질-해마 조직만 옮깁니다.
큰 조직 덩어리를 부수려면 1밀리리터 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 여러 번 분쇄합니다. 그런 다음 팁이 가는 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 7회 분쇄합니다. 30초 후, BSA 튜브 1에서 BSA 튜브 2로 1밀리리터의 하부 용액과 조직을 옮깁니다.
가는 팁 파스퇴르 피펫을 사용하여 BSA 튜브 2의 조직을 여러 번 분쇄합니다. 분쇄 후, BSA 튜브 1에서 BSA 튜브 3으로 용액 중 하부 조직 1밀리리터를 옮깁니다. BSA 튜브 3의 조직을 여러 번 분쇄합니다.
분쇄 후 튜브 2와 3의 모든 용액과 조직을 BSA 튜브 1로 옮깁니다. 2-3회 더 분쇄하고 3,000회 g에서 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 펠릿 조직에서 상청액을 조심스럽게 제거하고 P1000 피펫을 사용하여 2밀리리터의 완전한 Hibernate A 저형광 배지에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 조직을 20회 분쇄하여 조직 용액의 완전한 재현탁을 보장합니다.
그런 다음 30마이크로미터 셀 체를 통해 세포 현탁액을 폴리스티렌 샘플 튜브로 여과합니다. 300마이크로리터의 완전한 Hibernate A 배지를 필요한 수의 폴리프로필렌 튜브에 피펫팅하여 세포 분류 수집 튜브를 준비합니다.
분류할 각 형광 세포 유형에 대해 적절한 여기 및 방출 필터를 선택하십시오. 488나노미터 여기 파장을 사용하여 정맥 단백질을 여기시키고 530 over 40 방출 필터 세트를 통해 방출된 빛을 감지합니다.
531나노미터 여기 파장을 사용하여 TdTomato 단백질을 여기시키고 30개 이상의 방출 필터 세트에서 575개를 통해 방출된 빛을 감지합니다. 고순도를 위해 밝게 표지된 형광 세포를 분류하십시오. 세포 분류 후, 수집된 세포를 2밀리리터 둥근 바닥 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 세포를 3,000배g에서 3분 동안 원심분리 하여 세포 펠릿을 형성합니다.
마이크로리터당 1,000개의 세포 밀도를 달성하기 위해 필요한 양의 예열된 완전 NBA 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 해리된 세포의 존재를 확인하려면 4x 또는 10x 대물 렌즈를 사용하여 현미경으로 세포 용액을 확인하십시오. 세포를 도금하기 전에 중간 속도로 2-3초 동안 소용돌이치며 균일한 세포 현탁액을 보장합니다.
소용돌이 후 세포 현탁액 10마이크로리터를 각 커버슬립의 중앙에 빠르게 피펫팅합니다. 1시간 후, 세포에 500마이크로리터의 예열된 완전 NBA 배지를 공급하고 섭씨 37도에서 인큐베이터로 돌아갑니다.