Generation and Differentiation of Primary Neurospheres from Zebrafish Neural Stem Cells(제브라피시 신경 줄기세포에서 1차 신경구의 생성과 분화)

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신경과학

0 조회수 • 3:43 분 • July 8th, 2025

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성장 인자가 풍부한 성장 배지가 포함된 멀티웰 플레이트로 시작합니다.

제브라피쉬 신경 줄기 세포의 단일 세포 현탁액을 시드하고 배양합니다.

처음에 줄기세포는 성장인자를 이용하여 증식합니다.

파편을 제거하고 신선한 배지를 추가하여 지속적인 세포 증식과 자발적인 응집을 촉진하여 자유롭게 떠다니는 일차 신경구를 형성합니다.

다음으로, 신경구를 성장 배지가 들어 있는 신선한 우물로 옮깁니다.

동일한 조건에서 배양하여 신경구의 점진적인 확장을 유도합니다.

신경구를 기계적으로 작은 클러스터로 분리하기 위해 반복적으로 피펫팅합니다.

다음으로, 잘 코팅된 세포외 기질에 옮겨 접착을 촉진합니다.

성장 배지를 인슐린이 함유된 성장 인자가 없는 분화 배지로 교체하십시오.

성장 인자의 부재와 인슐린의 존재는 신경 돌기가 있는 신경교 세포 및 뉴런으로의 세포 분화를 자극합니다.

신경구 생성을 준비하려면 24웰 플레이트의 각 웰을 300마이크로리터의 신선한 Z-조건 배지로 채웁니다. 그런 다음 각 웰에 200마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하여 마이크로리터당 약 500개의 세포 밀도로 파종합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 30도에서 5% 이산화탄소에 배양합니다.

배양 1일 후, 현미경으로 24웰 플레이트의 세포를 관찰합니다. 이 단계에서 단일 세포 현탁액을 관찰할 것으로 예상합니다. 우물 중앙에 잔해물이 모인 것으로 보이면 약 100마이크로리터의 배지를 피펫팅하여 제거하고 100마이크로리터의 신선한 Z 조건 배지를 추가하여 이 액체를 교체합니다. 모든 파편이 제거되면 앞서 설명한 조건에서 플레이트를 배양합니다.

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양 하루를 추가한 후, 250마이크로리터의 세포 현탁액을 단일 웰에서 빈 새 웰로 옮깁니다. 24개의 웰 모두에 대해 이 단계를 반복합니다. 그런 다음 각 웰에 250마이크로리터의 신선한 Z-조건 배지를 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 현탁액을 균질화합니다. 동일한 조건에서 플레이트를 다시 배양하고 배양 하루 후에 이 확장 절차를 반복합니다. 이 기간의 셋째 날과 네 번째 날에 신경구의 크기가 점진적으로 증가하는 것을 관찰할 것으로 예상합니다.

계대를 시작하려면 4일 후에 각 웰에서 250마이크로리터의 배지를 제거하되 신경구는 제거합니다. 그런 다음 1밀리리터 피펫을 사용하여 나머지 배지 부피의 신경구를 기계적으로 해리합니다. 해리된 각 웰에서 세포 현탁액을 풀링합니다. 그런 다음 혈구계로 세포를 계수하고 마이크로리터당 800개의 세포를 포함하는 250마이크로리터의 1차 배양 상청액을 새로운 24웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 계속해서 각 웰에 250마이크로리터의 Z-조건 배지를 추가한 다음 이전에 설명한 대로 플레이트를 배양합니다.

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마지막 업데이트: 22 8월 2026