유도 만능 줄기 세포 유래 대뇌 오가노이드 생성

지지 매트릭스에서 배양된 유도만능줄기세포(iPSC)의 콜로니를 취합니다.

효소가 포함된 용액을 첨가하여 콜로니를 단일 세포로 해리시킵니다.

세포를 튜브로 옮기고 원심분리한 다음 상청액을 버립니다.

iPSC를 성장 배지에 재현탁합니다.

세포를 생체 적합성 폴리머 섬유가 포함된 마이크로플레이트로 옮깁니다.

원심분리하여 iPSC를 강제로 응집시켜 폴리머 스캐폴드에 배아체 또는 EB를 형성합니다.

iPSC의 증식 및 신경줄기세포, 전구세포 및 미성숙 뉴런으로의 분화를 촉진하는 신경유도 배지로 전환합니다.

배양 시 세포는 자기 조직화를 겪습니다.

배아체를 딤플 시트에 놓고 세포외 기질 단백질을 포함하는 방울을 추가합니다.

배양하여 매트릭스를 응고시키고 EB를 매립합니다.

EB를 신경 유지 배지가 포함된 마이크로플레이트로 옮깁니다. 인큐베이트.

EB는 세포 증식을 거쳐 돌출부와 발아를 형성하고 성숙한 뉴런으로 분화하여 대뇌 오가노이드를 형성합니다.

피펫으로 배지를 흡인하고 DPBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 세포 박리 용액 또는 0.5밀리몰 EDTA를 첨가하여 콜로니를 해리시키고 섭씨 37도에서 3-5분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 웰에 1밀리리터의 신선한 E8 배지를 추가하고 부드럽게 피펫팅하여 모든 세포를 분리합니다.

전체 세포 현탁액을 15mm 원심분리기 튜브로 옮기고 신선한 E8 배지 1ml를 더 추가합니다. 그런 다음 실온에서 3분 동안 290g에서 세포 를 회전시킵니다.

상청액을 버린 후, 세포 펠릿을 50마이크로몰 ROCK 억제제를 보충한 E6 배지 1밀리리터에 재현탁하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.

ROCK 억제제가 보충된 E6 배지에서 원하는 안정 밀도의 세포 현탁액을 준비합니다. 그런 다음 150마이크로리터의 세포 현탁액을 96웰 초저부착 플레이트의 각 웰에 추가합니다.

다음으로, 플레이트를 실온에서 3분 동안 290g 에서 원심분리하여 세포를 강제 응집시킵니다. 그런 다음 배아체 형성을 위해 5% 이산화탄소가 함유된 가습 분위기에서 플레이트를 섭씨 37도에서 배양합니다.

양 24시간 후, 플레이트를 후드로 옮기고 피펫을 사용하여 120마이크로리터의 배지를 조심스럽게 흡인하고, 피펫 팁을 웰 안으로 너무 멀리 내려 배아형 몸체가 흡인되지 않도록 주의합니다.

다음으로, 2마이크로몰 XAV939와 SMAD 억제제가 보충된 150마이크로리터의 신선한 E6 배지를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터로 다시 옮기고 매일 배지를 억제제가 보충된 새로 준비된 E6로 교체합니다.

배화 7일째에 모든 배아체가 직경 550-600마이크로미터에 도달하고 매끄럽고 선명한 가장자리를 표시하는지 확인합니다. 이 단계에서 세포외 기질에 내장될 준비가 되었습니다.

오가노이드를 매립하려면 빈 P200 상자에 4인치 길이의 열가소성 밀봉 필름 시트를 놓아 딤플 매립 시트를 준비합니다. 그런 다음 15밀리리터 원추형 튜브 또는 500마이크로리터 미세 원심분리기 튜브를 사용하여 필름 시트를 구멍에 부드럽게 눌러 12개 또는 원하는 수의 딤플을 만듭니다.

그런 다음 필름 시트에 70% 에탄올을 뿌리고 UV 조명을 켠 상태에서 후드 내부를 30분 이상 건조시킵니다. 한편, 얼음 위에 충분한 양의 기저막 매트릭스를 해동합니다. 그런 다음 와이드 보어 P200 팁을 사용하여 96웰 플레이트에서 각 딤플로 하나의 배아형 몸체를 옮깁니다. 일반 피펫 팁으로 가능한 한 많은 배지를 제거하되 배아체 몸체가 건조되지 않도록 하십시오.

다음으로, 미리 냉각된 일반 P200 팁을 사용하여 각 오가노이드에 약 30마이크로리터의 희석되지 않은 막 매트릭스를 추가하여 배아체 몸체가 액적의 중심에 최대한 가깝도록 합니다.

모든 배아체가 매트릭스에 매립되면 필름 시트를 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 페트리 접시를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소가 함유된 가습 분위기에서 10분 동안 배양하여 멤브레인 매트릭스가 응고되도록 합니다.

오가노이드 분화를 위해, 비타민 A가 없는 B27로 준비된 분화 배지 5밀리리터를 초저부착 6웰 플레이트의 웰 1개에 첨가한다. 인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도로 예열합니다. 멤브레인 매트릭스가 응고되면 필름 시트 뒷면에서 딤플을 밀어내어 내장된 배아형 몸체를 6웰 플레이트로 옮깁니다. 필요한 경우 웰에서 1밀리리터의 배지를 사용하고 시트에 피펫팅하여 필름 시트에서 물방울을 분리합니다.