미세유체 소자(microfluidic device)를 이용한 신경근접합부 생성

마이크로 그루브를 통해 연결된 거울 구획을 운반하는 상호 연결된 웰을 특징으로 하는 폴리머 코팅 미세유체 장치로 시작하십시오.

신경 전구 세포를 한 구획의 우물에 시드합니다.

상호 연결된 채널로 이동하여 폴리머에 부착되도록 합니다.

뉴런으로의 뉴런 성숙을 촉진하기 위해 성장 배지와 오버레이합니다.

반대쪽 구획에서 상호 연결된 채널에 이동하고 부착하는 근육 전구 세포로 우물을 파종합니다.

배지를 분화 배지로 교체하여 근육 전구 세포의 융합을 유도하고 다핵 근육 세포를 형성합니다.

성장 인자를 함유하는 뉴런 분화 배지를 근육 세포 함유 구획에 첨가한다.

한편, 절반 부피의 성장 인자가 없는 배지를 신경 세포 함유 구획에 첨가한다.

반대쪽 구획에 있는 성장 인자와 더 많은 양의 배지는 운동 뉴런이 미세 홈을 통해 과정을 확장하도록 촉진합니다.

그런 다음 이러한 신경 과정은 근육 세포와 연결되어 신경근 접합부를 형성합니다.

미세유체 장치에 신경 전구 세포(NPC)를 도금하려면 200마이크로리터 피펫을 사용하여 장치의 미세 홈의 한쪽에 있는 두 개의 웰에서 DPBS를 제거합니다. 오른쪽 상단 웰에 있는 장치당 60-100마이크로리터의 10일차 운동 뉴런 배지에 총 250,000명의 NPC를 시드하려면 세포 현탁액의 절반을 채널 개구부에 45도 각도로 시드합니다.

세포 현탁액의 나머지 절반을 하부 웰에 추가하기 전에 세포 현탁액이 채널을 통해 흐르도록 몇 초 동안 일시 중지합니다. 펜을 사용하여 시드된 면을 NPC 또는 이에 상응하는 것으로 표시하여 현미경 없이 장치의 방향을 쉽게 지정하고 세포 부착을 위해 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 2개의 NPC 시드 웰에 10일차 운동 뉴런 배지를 추가로 천천히 채우고 웰당 총 부피 200마이크로리터가 되도록 합니다. 200마이크로리터 피펫을 사용하여 새로 시드된 NPC 반대편에 있는 마이크로홈의 반대편에 있는 두 개의 웰에서 DPBS를 제거합니다.

웰당 200마이크로리터의 10일차 운동 뉴런 배지를 시드되지 않은 웰에 추가합니다. 그런 다음 배양 중 배지의 증발을 방지하기 위해 장치 주위에 10cm 접시당 6밀리리터의 DPBS를 추가합니다.

배지를 변경하려면 200마이크로리터 피펫 팁을 채널 개구부 반대편 웰 벽의 하단 가장자리에 배치하여 NPC가 있는 두 웰의 배지를 천천히 제거합니다. 강한 배지 흐름이 채널의 세포를 손상시키는 것을 방지하기 위해, 상부 웰과 하단 웰 사이를 지속적으로 변경하여 각 웰에 50 내지 100 마이크로리터의 신선한 운동 뉴런 배지를 천천히 첨가한다. 각 웰에 200마이크로리터의 배지가 포함될 때까지 이 과정을 반복합니다.

운동 뉴런 분화 17일째에 200마이크로리터 피펫으로 장치의 마이크로홈의 시드되지 않은 쪽에서 운동 뉴런 배지를 제거하고 DPBS로 웰을 세척합니다. 총 200,000개의 인간 일차 중혈관모세포 또는 MAB를 장치당 60 내지 100마이크로리터의 성장 배지에 시종하여 세포 현탁액의 절반을 상단 웰에 시종합니다.

NPC 도금에 대해 앞서 시연한 바와 같이 세포 현탁액의 나머지 절반을 바닥 웰에 시드하기 전에 세포 현탁액이 채널을 통해 흐르도록 몇 초 동안 일시 중지합니다. 세포 부착을 위해 장치를 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 새로 MAB로 파종된 두 웰에 추가 성장 배지를 채우고 시연된 대로 다시 배양합니다.

운동 뉴런 분화 21일째에 화학주성 및 체적 구배를 시작하려면 성장 인자를 포함하는 운동 뉴런 기저 배지의 웰당 200마이크로리터를 근관 구획에 추가합니다. 그런 다음 성장 인자가 없는 운동 뉴런 기초 배지의 웰당 100마이크로리터를 운동 뉴런 구획에 추가합니다.